酶免疫分析仪

1966 年，美国的Nakane 和Pierce 及法国的Avrameas和Uriel同时报道了以新的标记物--辣根过氧化酶替代荧光素，定位组织中抗原的酶免疫组织化学技术( enzyme immuno-histochemistry，EIH)。 1971 年，Engvall 和Perlmann 在酶免疫组织化学的基础上，又发展出一种酶标固相免疫测定技术，即酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosor-bent assay ，ELISA)，成为继荧光免疫、放射免疫分析技术之后的第三大标记免疫分析技术。 由于酶免疫测定技术(enzyme immunoassay，EIA)具有灵敏度高、操作简单易行、试剂有效期长，且对环境污染小等优点，使其自出现后不仅成为一种非常简便的研究工具，而且迅速被应用于各种血清学标志物和生物活性物质的临床检测，并在临床应用中逐步取代了放射免疫分析技术。20世纪70 年代中期，随着杂交瘤技术的发展，出现了单克隆抗体，将其应用于酶免疫测定中又极大地提高了酶免疫测定的灵敏度和特异性，使一步法双抗体夹心等酶免疫测定方法相继出现。 近年来，酶免疫分析技术飞速发展，酶免疫分析仪则是ELISA 测定的专用仪器。20世纪80年代初普通的酶免疫分析测定仪，即酶标仪商品问世。 我国于1981 年也生产出第一台酶标仪(510 型酶标比色计)。 最初的酶标仪是一种用于微孔板比色测定的光电比色计，经过不断改进，如今已发展为自动化、高效率、高精密度的测定仪。在酶标仪问世前，甚至在问世后的10多年间，临床实验室曾经历过依靠肉眼观察有无显色， 判读ELISA 检验结果的年代，直至20世纪90年代，酶标仪才逐渐在医院和血站临床实验室广泛投入使用。ELISA测定技术的应用和发展，国外陆续研发出具有各种各样功能的新型酶免疫分析仪，使酶免疫分析仪从单一的比色读板功能发展成为集多种功能为一体的全自动酶免疫分析仪，实现了一台机器可将ELISA实验从加样、孵育、洗涤、振荡、比色到定性或定量分析的各个步骤都根据用户事先设计的程序自动进行，直至最后完成报告存储与打印。 根据全自动酶免疫分析仪发展过程中所能达到的基本技术特征可将其分为三代产品。 第一代全自动酶免疫分析仪，实现了单/ 多针加样系统与酶标板处理系统一体化，但多数微孔板的孵育位置至少4块板。 第二代全自动酶免分析仪为非常任务和单一轨道，但由于不能同时处理两种过程(如洗板的同时，不能加试剂等)，因此，其工作任务表(或时间管理器TMS)的“堵车”现象仍无法避免，试验完成时间延长。 第三代全自动酶免分析系统的基本特征是采用多任务、多通道完全实现平行过程处理。 

酶免疫分析仪按其性能分为普通酶标仪和全自动酶免疫分析仪。 前者仅对ELISA结果进行比色，测量每一测试微孔的吸光度值；后者则是具有自动加样本、加试剂，自动控温温育，自动洗板和自动判读等功能的分析系统。

从20 世纪末至21世纪初，在国内各大医院和中心血站随着检验样品数量的增加，全自动酶免疫分析仪已成为工作的首选，使实验过程实现了标准化、规范化，提高了实验室的运行能力和检测的精确度、特异性和重复性，同时也避免了手工操作的误差，降低了操作人员的劳动强度，提高了操作人员的自身安全性。 目前国产酶标仪的发展无论在硬件和软件上还都滞后于国外产品，故国内医院和血站实验室应用的酶免疫分析仪还是以进口仪器为主，仪器品牌和型号已多达数十种，且不断有新型仪器问世。

根据检测对象的不同，酶免疫分析技术可分为两类:酶免疫组织化学技术和酶免疫测定技术，前者主要用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原或抗体，后者用于定性或定量检测各种体液样本(如血清、脑脊液、尿液、胸/ 腹水等)中可溶性抗原或抗体的存在。 酶免疫测定技术根据抗原、抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物，将酶免疫测定分为均相(homogenous)和异相(heterogenous)两种类型。 前者不需要分离结合和游离的酶标记物而直接进行测定。 后者需要对结合和游离的酶标记物进行分离后才能测定。

１. 均相酶免疫测定　测定对象为小分子抗原或半抗原，主要用于药物测定。 均相酶免疫测定的测定模式为竞争抑制法，酶标记的是待测抗原，检测试剂中尚有针对待测抗原的抗体和酶的底物，与抗体结合的酶就失去活力，因此在反应中无需分离结合的酶与游离的酶即可进行测定。 其反应过程与一般的生化测定无异，因此可直接用生化自动分析仪进行测定。 因主要测定药物，也有专用的测定仪器。

２. 异相酶免疫测定　医学检验中常用的酶免疫测定均为异相酶免疫测定，需将结合的标记物与游离的标记物分离才能进行测定。 若采用分离剂将结合和游离的酶标记物分离进行测定则称为液相异相酶免疫测定；若将一种反应物固定在固相载体上，当另一种反应物与之结合后，可通过洗涤、离心等方法与液相中的其他物质相分离，这类异相酶免疫测定称为固相酶免疫测定(solid phase ELA)，即ELISA，ELISA已成为固相酶免疫测定的通称。

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由于酶免疫分析技术具有高度的敏感性和特异性，酶免疫分析仪已广泛应用于临床医学实验室，已成为各级医院的检验科常用的检验诊断设备。 特别是全自动酶免疫分析仪具有更快速和简便、适用于大批量样品测定、易于进行质量控制的优势。

１. 病原体抗原及其抗体的检测　如各型肝炎病毒、艾滋病病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒、轮状病毒、流感病毒等血清学标志物，以及幽门螺杆菌、伤寒杆菌、布氏杆菌、结核杆菌等细菌感染和梅毒螺旋体、肺炎支原体、沙眼衣原体、寄生虫等感染的抗原或抗体血清学标志物检测。

２. 肿瘤标志物检测　如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)等。

３. 自身抗体的检测　如抗可提取性核抗原(extractable nuclear antigen,ENA)抗体组合、抗双链DNA 抗体、抗环瓜氨酸肽抗体(抗CCP 抗体)、抗心磷脂抗体、抗肾小球基底膜抗体等。

４. 细胞因子、激素及其受体和肽类物质的检测  如干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、人免疫反应性生长激素(irGH)、促肾上腺皮质激素、雌激素受体、肥胖相关肽、心血管调节肽等。

５. 其他　IgD、IgE、补体等。

一、性能的选择和应用

酶免疫分析仪在测定波长范围、吸光度范围、光学系统、检测速度、振板功能、温度控制、定性和定量测定软件功能等方面存在差异，全自动酶免疫分析系统还具有自动洗板、温育、加样等功能。

(一) 测定波长

一般酶标仪的测定波长在400~750nm或400~800nm，完全可以满足ELISA 的显色测定。 常见的ELISA试剂盒所使用的标记用酶均为辣根过氧化物酶(HRP)，底物通常为四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPD)，两者在过氧化氢溶液的存在下，经HRP 作用，分别氧化为联苯醌和２，２′-二甲基氨基偶氮苯(DAB)。TMB的氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，加入硫酸终止剂后，蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，可使产物稳定90min。 DAB产物用强酸终止反应后，最大吸收峰由450nm移至492nm，故450nm 和492nm两个波长是目前ELISA测定最常用的。 除了这两个基本的滤光片外，考虑到双波长比色的需要，还应有620nm或630nm 或650nm 和405nm 波长的滤光片，其他滤光片可根据自己的需要选择。 双波长比色除了用对显色具有最大吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长如630nm 进行测定，最后判读结果的吸光度则为两者之差。630nm波长下得到的吸光度是非特异性的，来自于板孔上注入指纹、灰尘、脏物等所致的光吸收。 因此，在ELISA 比色测定中，最好使用双波长，且不必设空白孔。

(二) 吸光度测定范围

早期的酶标仪可测定的吸光度一般在0~2.5，可以满足ELISA的测定要求，现在基本上可达到3.5以上，并且能保持很好的精密度和线性。 对于酶标仪不必去刻意追求大的吸光度范围，主要应看在一定的吸光度范围内的线性和精密度。

(三) 光学系统

通常为8或12通道，亦有单通道检测。 除测定通道外，有的酶标仪还有一个参比通道，每次测定可进行自我校准。 酶标仪的光学系统功能如何，均可通过酶标仪测定的吸光度范围、线性度、精密度和准确度等体现。 测定的精密度与测定通道之间的均一性有直接关系。 单通道可避免因通道不同所致的差异。

(四) 检测速度

检测速度是指其完成比色测定所需要的时间。检测速度快，有利于提高检测的精密度，即避免测定过程中，因测定时间不同所致的各微孔间吸光度的差异。 目前市场上常见的酶标仪检测速度都非常快，通常在数秒钟内。

(五) 震板功能

酶标仪的震板功能是指酶标仪在对ELISA板孔进行比色测定前对其进行振荡混匀，使板孔内颜色均一。 目前市场上常见的酶标仪均有震板功能，所不同的是震板方式，有的可按上下、左右或旋转等方式及振荡幅度等任意调节。 使用有震板功能的酶标仪，在进行ELISA 测定显色反应完成加入终止剂后，可不必振荡混匀，直接放入酶标仪上测定即可。

二、维护保养和校正

操作人员应能对仪器进行一些简单的测试和清洁等维护工作，保持仪器处于良好的工作状态，即按照仪器的维护保养指南进行日常维护、月维护和定期维护。

(一) 日常维护

仪器的类型不同日常维护的程序和内容也不同，普通酶免疫分析仪的日常维护比较简单，全自动酶免疫分析仪尚需对仪器的加样、洗板系统等进行维护，主要包括:①保持仪器工作环境和仪器表面的清洁，可用中性清洁剂和柔软的湿布擦拭仪器的外壳，清洁仪器内部样品盘和微孔板托架周围的泄漏物及冰箱周围的冷凝水等。 ②检查加样系统的工作情况，执行清洁加样针程序，如加样针外壁有蛋白类物质沉积，需手工清洁加样针。 ③用蒸馏水清洁洗液管路及洗板机头等。

(二) 月维护

需关闭仪器电源，拔下电源插头操作。 ①检查所有管路及电源线是否有磨损和破裂，如果破损则更换。 ②检查样品注射器与加样针间管路是否泄漏及破损，如果破损则更换。 ③检查微孔探测器是否有堵塞物，如有则可用细钢丝贴着微孔底部轻轻将其除去。 ④检查支撑机械臂的轨道是否牢固，并检查机械臂及其轨道上是否有灰尘，如有则可用干净的布将其擦净。

(三) 定期维护和校正

重点是在光学部分，防止滤光片霉变，应定期检测校正，保持良好的工作性能。

1.滤光片波长精度检查　将不同波长的滤光片从酶标仪上卸下，在波长精密度较高(波长精度±0.3nm)的紫外-可见光分光光度计上的可见光区对每个滤光片进行扫描，其检测值与标定值之差为滤光片波长精度。

2.通道差与孔间差检测　通道差检测是取一只酶标板小孔杯(杯底须光滑、透明、无污染)，以酶标板架作载体，将其(内含200μｌ 甲基橙溶液，吸光度调至0.500Ａ 左右)置于8个通道的相应位置，蒸馏水调零，于490nm处连续测3 次，观察其不同通道的检测器测量结果的一致性，可用极差值来表示。 孔间差的测量是选择同一厂家，同一批号酶标2板条(8条共96孔)分别加入200μl 甲基橙溶液先后置于同一通道，蒸馏水调零，于490nm 处检测，其误差大小用±1.96s衡量。

3.零点飘移(稳定性观察)　取8只小孔杯分别置于8个通道的相应位置，均加入200μl 蒸馏水并调零，于490nm处每隔30min 测1次，观察各个通道4h内吸光度的变化。

4.精密度评价　每个通道3只小杯分别加入200μl 高、中、低3种不同浓度的甲基橙溶液，蒸馏水调零，于490nm做双份平行测定，每日测2次(上、下午各1次)，连续测定20天。 分别计算其批内精密度、日内批精密度、日间精密度和总精密度及相应的CV值。

5.线性测定　用电子天平精确称取甲基橙配制5个系列的溶液，于490nm 平行测8次，取其均值。 计算其回归方程，相关系数及标准差s，并用±1.96s表示样品测量的误差范围。 双波长测定评价:取1份甲基橙溶液，分别加入3种不同浓度的溶液(测定波长为490nm，校正波长为585nm)，先后于8个通道检测，每个通道测3次，比较各组之间是否具有统计学差异，以考察双波长消除干扰组分的效果。

医院检验科应定期对其所使用的酶免疫分析仪进行校准检定，主要检定指标包括波长准确度、吸光度准确性、吸光度重复性等。 通常市级计量测试单位提供该项服务，并出具检定合格证书。

三.质量控制

对检验结果的质量实施有效控制，保证结果数据具有良好的精密度、准确度和可信度。质量控制包括室内与室间质量控制。

（1）室内质量控制：室内质控是由实验室技术人员采用一系列统计学的方法，连续评价本实验室测定工作的可靠程度，判断检验报告是否可发出的整个过程。室内质量控制是实验室质量控制保证体系中的基本要求之一。

室内质控的质控品可模拟患者样本的诸多特性，且在监控免疫化学分析系统的特性时，显得十分重要。①传染性标志物质控要求：在检测传染性标志物时，除了试剂盒内的阴、阳性对照外还应加入至少包含两个分析物水平的质控品。一个为弱阳性（即在灰区内水平的质控），另一个为阳性质控。弱阳性质控品：接近Cutoff值，S/CO值应该为2〜4之间；每批次（每块微孔反应板）做一次质控。试剂盒更换时应作批间、批内比对。②每个实验室需确立自身适用的S/CO的均值和可接受的范围，以确保合适的测试性能。若质控结果未落在可接受的范围内，表明存在无效的测试结果。应及时查找原因，书写失控报告。

1）室内质控操作步骤：①质控的准备：测试环境、试剂的要求：室温：20~25℃；湿度：<80%；仪器状态良好；试剂：所用试剂均为评估过的并且合格产品。②质控样品的准备：从冰箱中取出质控物，放置至室温（约30分钟），待质控物平衡好后即与检测标本一同检测。③质控样本的测定：每天按实验室有关室内质量控制的规定对室内质控进行两个水平的质控物测定。检测完毕，检测数据应记录在各种质控登记本上。质控品测定“在控”，才能发出病人患者样本的检验报告。④绘制质控图及记录质控结果。

根据质控品的靶值和控制限绘制Levey-Jennings质控图（单一浓度水平）。以Y轴为质控品测定的S/C0值，X轴为测定次数N。在Levey-Jennings质控图上Y轴刻度上一般提供x±3s范围。

2）室内质控失控措施：①超出规定的靶值或质控品规定的参考范围为失控，发生失控后，各专业组相关人员应立即上报室负责，并集中分析失控原因。②找出原因，经纠正后须重新测定质控品，以“在控”来确认问题解决与否，在失控时测定的患者样本也须重测，应将出现的质控事件和纠正过程形成文件。

（2）室间质量评价：室间质评是由第三方机构采用一系列的方法连续地、客观地评价各实验室的试验结果，并发现实验室本身不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，帮助其校正，使其结果在具有可比性。临床实验室全面质量管理重要组成部分，也是实验室认可的重要依据。旨在建立实验室间结果的可比性。

目的是对检验科参加室间质量评价的全过程，包括室间质评计划的制订、质评项目的确定、质控标本的接收、分发、检测、结果报送、结果回报后质评结果的分析以及不合格项的处理等进行控制，以保证检验结果的可比性。了解本实验室测定结果的准确性和实验室检测能力所处的水平。

1）室间质评的准备：在建立实施室内质控体系的基础上，参加室间质评活动。收到质控物后认真检查核对，如有破损、缺失、标本编号错误等及时向科室反映，以便及时与部临检或省临检中心联系，及时补寄。仔细阅读室间质评的通知和要求，由质量监督（该项目检验人员）负责人将质评样本保存在2〜8℃冰箱，妥善保管好报表和项目编码。

2）质评样本检测操作：①测试环境、仪器、试剂的准备：室温20〜25℃；湿度<80%；仪器必须有质量控制保证。在进行室间质评前，应先进行仪器校准；所用试剂盒必须选用国家食品药品监督管理局批准合格的试剂盒；选用试剂盒的检测灵敏度必须符合临床要求。②质评样品的准备：按测定日期从冰箱中取出参评物，放置至室温（约30分钟）。根据标本种类、质控品要求，用相应溶剂将质控品溶解。如果是液体质控品则平衡好后即可测定。③质评样品的测定：将平衡好的质控品、室内质控、与临床标本一同检测。如果质控品量多可重复3次。计算平均浓度，去除仪器测定中产生的误差。

3）室间质评结果的上报：室间质评结果可填写报表或网上回报，填写报表时应按要求逐项填写，字迹清晰整洁。填写完后再次核对，以防笔误、样本号顺序错误等。然后测定者、室负责人签字。

每半年进行科内的室间质控考评2次。每年参加卫生部室间质控。具体检测时间按科室或卫生部室间质评检测时间安排进行。

4）反馈结果的评价：收到反馈报告后要及时分析，检查各项目的准确程度、有无系统性误差、有无不合格项目，对不合格项目需要分析失误的原因。

5）失控结果的处理：将所有的失控调查原因及纠正措施做好记录，并上报科质量控制小组和科主任，由科主任签字后，质控结果归档保存。

四.ELISA免疫分析结果的干扰因素

（1）测定方法和试剂的影响：试剂灵敏度及特异性差；试剂保存不当失效、洗液污染或水质有问题；显色剂污染或混用；显色剂失效。反应温度高、时间过长；反应温度低、时间过短。

（2）标本自身及前处理所造成的干扰因素：标本溶血、黄疸；标本反复冻融；标本、试剂加样量过高；标本或试剂加样量不足；加错或漏加标本。

（3）“钩状效应”的影响：由于待检标本中抗原浓度的显著升高，而致捕获抗体不足所造成的检测结果假阴性或假阳测定值。

（4）交叉污染的影响：酶标板未洗净；设备加样针拖带；洗板机针孔堵塞，未洗净，酶标板清洗次数过多。

（5）操作流程对结果的影响：竞争法加样本时间过长后再加酶，造成不公平竞争。

1.人员要求  要求检验技术人员应全面了解和掌握，酶联免疫吸附试验基本原理、实践操作及影响因素，经过全自动酶联免疫分析仪培训的检验人员方可进行检测系统的操作。

2.仪器的设备及试剂

（1）设备：ELISA法检测的常用仪器设备：①全自动酶联免疫分析仪；②酶标仪；③洗板机。

（2）试剂：ELISA试剂均应具有相关部门注册，商品化的专用试剂盒。

3.仪器的校准  ELISA法常用的仪器有单独的洗板机和酶标仪，全自动酶标仪。

（1）酶标仪（酶标比色仪）的校准：通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。应定期对上述指标进行校准。

优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。超出可测上限的A值常以“*”或“over”或其他符号表示。

双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。

（2）洗板机的校准：洗板机的校准指标：①是每次吸液后，板孔中液体的残留量；②是与加液和吸液之间所间隔的时间，另外对如震荡、涡流、底部冲洗、两点吸液、连续式冲洗等多种功能都进行校准。

4.不确定度 目前常用ELISA检测试剂大多无不确定度信息，仅有部分试剂生产厂家进行了试剂盒检测符合率的比较。

ELISA检测试剂的不确定度可采用与仪器性能验证相同的方法进行。