荧光免疫分析仪

1941 年，Coons和Kaplan 用荧光素和抗体结合来定位组织中的抗原，从而提出了荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay，FIA) 的概念。 荧光素等有机荧光分子一直是分析领域中常用的标记物。 在特定光的激发下，某些有机荧光分子很容易被激发至饱和状态并发出荧光，而这些荧光分子还能在很短的时间内进行多次的重复激发和测量。 正是因为有机荧光分子的这些特点，自20世纪70年代以来，Ambrose 、Mathies 和Nguyen 等分别成功地实现了荧光单分子检测。 然而，在实际检测分析中，由于生物制品、溶剂及溶质等的散射光、本底荧光及化学发光物质的干扰，以及荧光染料之间的一些光谱重叠，使检测所受的干扰极多，致使传统荧光分析的敏感性大大降低，其灵敏度仅是理论值的0.1％ ~1％ ，很难适应对微量抗原抗体的检测识别。

在这个大背景下，两种现代荧光免疫分析方法迅速发展。 荧光偏振免疫分析法(fluorescence po-larization immunoassay，FPIA)就是其中之一，它以快速、精确和特异的优势很快便为人们广泛接受。1983年，Soini 和Kojola 等首先报告以镧系元素为标记示踪螯合物与时间分辨荧光测量相结合，建立了一种新的非放射性微量分析技术——时间分辨荧光免疫分析( time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)，它便是第2种现代荧光免疫分析技术。TRFIA以镧系元素标记抗原或抗体，用时间分辨技术测量荧光，有效地排除了样品中的非特异荧光干扰，大大提高了分析的灵敏度，一举成为标记免疫分析技术中的新秀。

用于临床检验的免疫荧光分析技术主要有四种:免疫荧光显微分析、时间分辨免疫荧光分析(time-resolved flu-oroimmunoassay，TRFIA)、荧光偏振免疫分析(fluorescence polarizaation immunoassay，FPIA)、液相芯片技术，下面逐一进行介绍。

(一) 免疫荧光显微分析

免疫荧光显微技术是利用荧光显微镜观察细胞内或细胞表面结合的荧光抗体，从而对目标蛋白进行亚细胞水平定位和相对丰度的检测。 基本过程是用温和的去污剂处理标本切片中的组织或细胞，使细胞膜被溶解，促进荧光抗体进入细胞，与细胞中的抗原进行反应。 用甲醛固定细胞使其形状和所有细胞蛋白质的定位保持稳定。 洗去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，当激发光照到荧光染料上时，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。

根据荧光抗体染色方法可分为直接荧光抗体法、间接荧光抗体法和补体荧光抗体法三种。

1.直接法　这是荧光抗体技术最简单和最基本的方法，将待测样本固定在玻片上，滴加荧光抗体于待测样本片上，经反应洗涤后在荧光显微镜下观察。 标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体结合，在显微镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。原理如图15-2。

图15-2　直接荧光抗体法原理

２. 间接法　主要用于检测血清中的抗体。 将特异性细胞或抗原固定在玻片上，第一步将待测样本(第一抗体)加在已知抗原的玻片上，反应一定时间后，洗去未结合的抗体，第二步滴加荧光物质标记的第二抗体，如果第一步反应中抗体与抗原发生结合，此时加入的第二抗体即与第一抗体发生反应，形成抗原-抗体-荧光物质标记第二抗体复合物，在荧光显微镜下显示荧光。 此法的灵敏度高于直接法，只需制备一种荧光物质标记的二抗，就可检测同种动物的多种抗原抗体系统。 原理如图15-3。

图15-3　间接荧光抗体法原理

间接免疫荧光法(IFA)是检测自身抗体的良好工具，在自身免疫疾病的实验室诊断中应用广泛。主要有抗核抗体、抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体、抗着丝点抗体、抗中性粒细胞胞质抗体等。 目前临床常规检测抗核抗体(antinuclear antibody ，ANA)一直沿用IFA 法作为总的ANA 筛查试验。

在病原体抗体检测中，间接免疫荧光法是公认有效的检测疟疾和肺炎衣原体抗体的方法，灵敏度和特异性均很高。 商品化的呼吸道感染IgM九项联检试剂盒(间接免疫荧光法)已经广泛应用于呼吸道疾病的诊断，可同时检测肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌、Q热、呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3。 该产品将9种病原体或病毒感染的细胞固定在玻片上，吸附剂处理后的样本加入到玻片孔中与固定抗原反应，洗涤后加入FITC 标记抗人IgM第二抗体和伊文斯蓝染料，洗去未反应的物质后，在荧光显微镜下观察结果，阳性样本可见绿色荧光和红色背景(细胞包被孔)，见图15-4。

图15-4　呼吸道九项联检荧光图谱

3.补体法　此方法是间接法的一种改良，利用补体结合反应的原理，即在抗原抗体反应时加入补体(多用豚鼠补体)，再用荧光物质标记的抗补体抗体进行示踪。 此方法的优点是只需制备一种荧光物质标记的抗补体抗体即可检测各种抗原抗体系统(凡是能固定补体者)，不受抗体来源的动物种属限制，敏感性也较高，缺点是容易出现非特异性染色，而且操作过程较复杂。

(二) 时间分辨免疫荧光分析

时间分辨荧光免疫分析是一种非放射性标记免疫分析技术，与传统的荧光素标记不同，它是以镧系元素，如铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)、铌(Nd)等为标记物。 因此，又称为解离-增强镧系元素荧光免疫分析。 在传统的荧光标记免疫中，标记物采用的是异硫氰酸荧光素，其激发光和发射光谱Stokes位移较小，只有28nm，由于常有部分重叠，测量荧光强度时不可避免地产生干扰。Eu和Tb 类螯合物标记抗体抗原进行免疫分析具有以下优越性:①激发光谱带较宽，激发最大波长在300~500nm，有利于增高激发能，提高标记物的比活性。 ②发射光谱带很窄，甚至不到10nm，有利于降低本底，提高分辨率。③Stokes位移较大(250~350nm)，有利于排除非特异性荧光的干扰。 ④荧光寿命长，一般镧系元素螯合物的荧光衰变时间在60~900μｓ，常用的Eu³⁺ 荧光衰变时间为714μs，而普通荧光免疫分析中的荧光团的荧光衰变时间只有1~100μs，样品中的一些蛋白质的荧光衰变时间也很短，仅为1~10μs。 因此延迟测量时间，待背景荧光完全衰减后测定，所测的便是稀土络合物的特异性荧光，从而消除蛋白质背景荧光的干扰。 ⑤稀土元素标记物比较稳定，可以保存1~2年，克服了同位素、酶标等不稳定的缺点。

目前用于TRFIA的镧系元素为铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)、铌(Nd)和镝(Dy)，常用的是Eu、Tb和Sm。 稀土元素不能直接与蛋白连接，需要利用具有双功能基团的螯合剂将稀土元素与蛋白分子氨基连接，现常用的螯合剂有:多胺多羧类螯合剂、菲罗啉类螯合剂、水杨酸类螯合剂、β-二酮类螯合剂、联吡啶类螯合剂等。

从20 世纪80年代至今，时间分辨荧光免疫分析系统已有四种系统，即DELFIA 系统、FLAgen 系统、TBP系统、EALL系统，它们均有各自的特点和应用。

(三) 荧光偏振免疫分析(fluorescencepolarization immunoassay，FPIA)

荧光偏振免疫分析原理　从光源发出的一束光线经垂直起偏器后成为垂直偏振光，荧光素标记的样品被垂直偏振光激发而产生偏振荧光，此荧光经检偏器后可测出与样品浓度有关的水平或垂直方向的荧光偏振光强度，见图15-5。

图15-5　荧光偏振仪的光学原理

(四）液相芯片技术

液相芯片技术是20世纪90年代后期发展起来的被喻为后基因组时代的芯片技术，它将流式检测技术与芯片技术有机地结合在一起，一方面大大延伸了流式检测平台，以微球体代替细胞作为反应载体，这个相当开放的反应体系可进行蛋白、核酸等等生物大分子的检测。 迄今为止十年时间，全球已有数百套基于ｘMAP 技术的检测平台用于免疫学、蛋白质、核酸检测、基因研究等领域，该技术已成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具，也是最早通过美国食品与药物管理局(FDA)认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。

液相芯片技术又称流式荧光技术、悬浮阵列、液态芯片技术等，该技术的核心是把微球用荧光染色的方法进行编码，通过调节2种或3种荧光染料的不同配比获得最多可达500 种具有不同特征荧光谱的微球，然后将每种编码微球共价交联上针对特定检测物的抗原、抗体或核酸探针等捕获分子。应用时，先把针对不同检测物的编码微球混合，再加入微量待检样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的捕获分子发生特异性结合，在一个反应孔内可以同时完成多达100种不同的检测反应。 最后用Luminex 仪器进行分析，仪器通过两束激光分别识别微球的编码和检测微球上报告分子的荧光强度。液相芯片技术最突出的优点在于:仅需少量样本即可同时定性、定量检测同一样本中的多种不同目的分子，即多重检测(multiplexing)。 具体说来，与常规免疫学或核酸检测方法相比，液相芯片技术具有以下特点:高通量、样本用量少、操作简单、快速、灵敏度高、检测范围广、特异性强、准确性高、重复性好、费用低、灵活。

YY/T1304.1-2015时间分辨荧光免疫检测系统第1部分：半自动时间分辨荧光免疫分析仪 

本部分规定了半自动时间分辨荧光免疫分析仪的术语和定义、要求和试验方法、标识、标签和使用说明书、包装、运输和贮存。本部分适用于单标记时间分辨荧光免疫分析。本部分不适用于双标记及多标记时间分辩荧光免疫分析，2015年3月发布，2016年1月日开始执行。

YY/T 1304.2-2015时间分辨荧光免疫检测系统第2部分：时间分辨荧光免疫分析定量测定试剂（盒）。

本部分规定了时间分辨荧光免疫分析定量测定试剂(盒)(以下简称试剂盒)的术语和定义、要求和试验方法、标识、标签和使用说明书、包装、运输和贮存。本部分适用于单标记时间分辨荧光免疫分析。本部分不适用于双标记及多标记时间分辨荧光免疫分析。2015年3月发布，2016年1月日开始执行。 

YY/T 1533-2017  中文名称：全自动时间分辨荧光免疫分析仪

本标准规定了全自动时间分辨荧光免疫分析仪(以下简称分析仪)的要求、试验方法、标志、标签和使用说明书、包装、运输和贮存。本标准适用于全自动时间分辨荧光免疫分析仪。2017年3月发布，2018年4月日开始执行。

荧光偏振免疫分析应用：

单克隆抗体技术和荧光显微技术的结合为疾病的实验室诊断提供了方便有效的技术手段，可用于测定细胞表面抗原和受体；各种病原微生物的快速检查和鉴定；组织内抗原的定性和定位研究；以及各种自身抗体的检测等。

 直接荧光抗体法常用于细菌、病毒等的快速检查和淋巴细胞表面抗原与受体的鉴定，样本材料可以是培养物、感染组织、患者分泌物和排泄物等， 对多种病原体的实验室诊断有较好的效果。

间接荧光抗体法常用于自身抗体和病原体抗体的检测。

荧光偏振免疫分析应用：

（1）在药物方面的应用：FPIA 在血药浓度的检测中具有较高的特异性和稳定性，适用于临床各种小分子药物的定量测定，包括治疗性药物浓度测定:环孢素、卡马西平、苯妥英钠、丙戊酸、地高辛、氨苯碱、苯巴比妥等；滥用药物浓度测定:鸦片、酒精等。

（2）在研究分子间相互作用方面的应用：FPIA在受体/ 配体(如激素/ 受体检测)、蛋白质/ 多肽相互作用、DNA/ 蛋白质相互作用中发挥着重要作用。FPIA 利用受体和配体结合后，该复合物运动方向和速率较前发生变化，荧光物质运动受影响，其受偏振光激发产生的激发光与原先激发光性质不同的原理进行分析，其他分子间相互作用也必然发生运动方向和速率方面的变化，可见FPIA 是目前这类研究的最适方法。

（3）在微生物方面的应用：自从FPIA 应用于单核苷酸多肽性及基因型的检测以来，研究均表明:相对于PCR而言，FPIA 具有简单、经济、特异性好、准确性高、检测范围广和高通量等优点。 可以利用FPIA 检测病人样本中病毒DNA 如HBV、HPV的复制量，与多聚酶链反应-酶联免疫吸附试验(PCR-ELISA)方法作比较，符合率更好。

（4）在肿瘤方面的应用：恶性肿瘤细胞胞内各种物质表达异常，导致胞质黏度等物理因素改变，EPIA的荧光物质在进入细胞后受到物理因素改变的影响，受偏振光激发产生的激发光与正常细胞不同，分析偏振光性质以了解细胞内环境变化，有助于肿瘤早期诊断。