微生物鉴定药敏分析仪

临床微生物学家的一个重要角色就是分离、鉴定和分析引起人类感染性疾病的病原微生物,其重要性主要体现在三个方面:①从患者标本中培养到可疑病原微生物；②分离微生物并进行分类和鉴定确认；③预测和解释相关病原微生物对抗菌药物的敏感性。

培养方法依然是经典微生物学的金标准,数十年来,微生物检验经历了商品化鉴定系统从手工、半自动到全自动的发展过程。过去,微生物学者一直依靠肉汤、琼脂培养基培养和分离细菌,其生化和代谢特征可用于鉴定微生物的属种。从临床标本中分离到可疑的感染病原菌,常规鉴定需在特殊的碳水化合物或生化底物上培养24～48h。

从1950年末到1960年,传统的生化试验趋于小型化,开始引进小管试验和塑模的容器。然而,简便的试验未能改善对报告结果的周转时间(turn around time, TAT)。1970年,微生物学家开始依靠计算机的数据库,同时处理大量的结果,利用统计学的可能结果来鉴定未知微生物。虽然因此提高了结果的重复性,但仍未能缩短报告时间。

1966年,Bauer及其同事共同建立并标准化的纸片扩散法(Kirby-Bauer法),因其选药灵活、价格便宜,现仍广泛用于各国的临床微生物实验室,但由于此方法未能更好地实现自动化操作,且是定性检测,其发展受到了一定的局限。1970年以前,临床微生物实验室主要采用手工操作的方法进行药敏试验。

1974年,Pfizer公司推出第一台自动化药敏分析系统应用于临床检测,届时,已有将鉴定和药敏系统的判读及数据库系统集成一体,形成半自动鉴定和药敏仪,使许多实验室缩短了TAT时间,提高了劳动效率,得到了比原来更准确的试验结果。20世纪80年代初,第一代VITEK系统对大多数快生长的需氧菌能够在4～10h内快速鉴定,将微量肉汤稀释法应用于商品化的自动化操作,半定量的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)卡问世。

20世纪80年代初,美国BIOLOG公司开发了一种新的微生物鉴定方法——代谢指纹法,根据细菌对碳源(或氮源)利用的差异来区别和鉴定细菌,并将其应用于微生物的自动化检测。

随着先进技术的飞速发展并向微生物学的渗透和多学科的交叉,微生物的鉴定逐渐向快速化、微机化、全自动化方向发展,且取得了许多突破性的进展,出现了很多自动化微生物检验系统、微生物自动鉴定系统和药敏分析系统。

1999年底法国生物梅里埃公司(BioMérieux Inc.)推出VITEK2系统,次年在美国上市,从接种物稀释、密度计比较及卡冲填和封卡等步骤均实现了自动化。随后,MicroScan Walkaway 40/96、Phoniex100和Sensitire 2X全自动鉴定药敏仪陆续上市,进入全自动药敏试验发展的飞跃期,这些快速、准确、简易、自动化程度高的方法技术,大大缩短了实验室的检测时间,提高了检测的准确性及标准化程度,产品还在不断改进和软件更新升级,以适应行业发展的需要,成为全球全自动微生物鉴定药敏仪的主流产品。

中国的微生物鉴定药敏分析仪虽起步于20世纪90年代，但发展速度较快,近年来已经形成一定的市场规模,其成本控制、用药选择能较好适应国内用户的实际需求,且供货速度较快。目前,国产微生物鉴定药敏仪的产品质量稳步提升,逐渐得到用户的认可。

20世纪70年代,在微量生化反应的基础上,将恒温孵育箱辅以读数仪和计算机分析软件,从而形成半自动化微生物检测鉴定系统。 从早期的半自动检测系统到目前的全自动快速检测系统,可鉴定的微生物种类范围不断扩大,鉴定速度越来越快,自动化程度也越来越高。特别是近年来推出的一些新型检测仪中,加入了专家系统,该专家系统可根据药敏试验的结果提示存在何种耐药机制,对临床正确、合理使用抗生素有很大的帮助。

根据自动化的程度,鉴定药敏分析系统分为半自动分析系统和全自动分析系统。半自动分析系统仅有结果判读装置,采用终点法对结果进行判读并解释。全自动分析系统对加样、孵育、结果判读一体化,采用速率法或者终点法对结果进行判读和解释。进口产品有半自动和全自动鉴定药敏仪,本国产品目前只有半自动鉴定药敏仪。以下按英文字母顺序分别介绍各生产厂家的全自动和半自动微生物鉴定药敏设备。

一、全自动化鉴定药敏系统

1.MicroScan自动微生物鉴定及药敏测试系统 MicroScan自动微生物鉴定及药敏检测系统是由原美国Dade Behring公司所生产的全自动系统,后被德国西门子公司收购,现刚完成被美国贝克曼库尔特公司的收购。MicroScan WalkAway自动系列采用8进制计算法分别将28个生化反应转换成8位生物数码。计算机系统自动将这些生物数码与编码数据库进行对比,获得相似系统鉴定值。快速荧光革兰阳性和革兰阴性板则根据荧光法的检测原理,将荧光物质均匀地混在培养基中,将菌种接种到鉴定板后,通过检测荧光底物的水解、底物被利用后的pH变化、特殊代谢产物的生成和某些代谢产物的生成率来进行菌种鉴定。系统主要由WalkAway96仪器、测试板、快速接种系统和数据管理系统四部分组成。此系统的特点是可根据用户需要选择传统和快速检测板(荧光法),快速检测板2．5h可出鉴定报告,传统检测板需6～18h,此系统的鉴定准确率高。

2．PhoenixTM 100全自动细菌鉴定药敏检测系统 PhoenixTM 100 全自动细菌鉴定药敏检测系统由美国BD公司(BD Diagnostics)生产,细菌鉴定原理是利用比色与荧光相结合的检测方法,45个鉴定反应孔中包被了传统生化反应底物(色原底物)及荧光底物,以三色(红、绿、蓝)光检测反应孔的颜色变化、以荧光检测反应孔的荧光强度进行实时、连续监测,将得到的数据利用内置的运算法则进行运算并分析,从而得出鉴定结果；药敏试验主要是通过比浊法和氧化还原反应进行检测。Phoenix系统由PhoenixTM 100 主机( PhoenixTM50)；BBL比浊仪；BDXPertTM微生物专家系统；BD EpiCenterTM微生物实验室专业数据管理系统等组成。Phoenix系统在鉴定准确的基础上还大大提高了检测速度,平均鉴定时间3h。

3.Sensititre ARIS 2X全自动微生物鉴定和药敏分析系统 Sensititre 先德微生物鉴定和药敏分析系统是由英国TREK Diagnostic Systems LTD．生产,1992年在美国上市,于2011年7月被美国ThermoFisher Scientific(赛默飞公司)收购。仪器ARIS包括自动孵育和自动判读系统。2004年,新一代的仪器Sensititre ARIS 2X上市,能容纳64块标准的96孔卡。试验卡分别是单独的鉴定板和药敏板,每块试验卡能够同时鉴定3株细菌。

根据细菌新陈代谢分解微量检测板中特定的底物和荧光物质从而形成游离荧光分子团,产生较强的荧光信号。仪器自动判读荧光强度,将获得的生化反应结果转化成十六进制生物编码,分析得出细菌鉴定概率,结合生化反应符合率等参数,综合评价鉴定结果的可接受性。药敏试验采用美国CLSI标准推荐的微量肉汤法,可获得相应的MIC值,有近300种抗菌药物可供实验室选择。药敏板包括4～12个稀释浓度的全值板和1～4个稀释浓度的阈值板。由于荧光的高灵敏性,所以大部分细菌的药敏结果可在5h内判读MIC值,大大提高了检测的灵敏度和精确度。可自动完成对检测板的孵育、读板和数据分析并报告结果。也可通过肉眼判读浊度得出药敏的MIC值。荧光检测不会影响细菌生长产生的浊度变化。

4.VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统  VITEK系统是20世纪60年代美国宇航探索计划的副产品,原属美国麦道公司,后被法国生物梅里埃公司收购。2000年,自动化程度更高的新一代VITEK自动化鉴定药敏系统在美国注册上市,包括VITEK 2和VITEK 2 XL,分别能够同时容纳60张和120张配套的64孔塑料试验卡；鉴定卡与药敏卡单独分开,药敏卡覆盖9～20种抗菌药物,每种药物包含1～6个浓度；2005年,更适合中小型实验室使用的智能VITEK 2 Compact上市,但配套的试验卡与VITEK 2相同,分别有能够运行15张、30张或60张试验卡的软件。

VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统操作更具人性化,且扩大了微生物数据库。其鉴定原理为多参数显色法,仪器每隔15min自动检测每孔透光度变化,达到判读阈值时,指示已完成反应,仪器自动对数据进行处理分析,得出最后结果及报告可信指数。系统由VITEK 2 Compact主机(液晶显示器、键盘、真空充填室、装载室、判读模块封口和废卡接收箱)、计算机、打印机、数字显示电子比浊仪、条码扫描器等组成。VITEK 2 Compact系统的鉴定卡片种类多,平均鉴定时间为5h。在细菌鉴定能力上,已发表文献评估其准确率在90%以上。

二、半自动微生物鉴定药敏系统

半自动微生物鉴定药敏系统是在手工商品化鉴定试剂盒和微量肉汤稀释法药敏(折点判断和MIC判读)的基础上,经过夜的恒温孵箱培养后,利用相应仪器判读生化结果和药敏生长浊度,计算机根据与数据库模式菌的结果比较,判断鉴定结果和药敏结果。半自动鉴定药敏仪是全自动鉴定药敏仪研发前的产品,其以鉴定板种类多、可检测真实MIC值为优势,与全自动系统相比,手工操作较多和报告时间相对较长。国产微生物鉴定药敏系统目前均是半自动检测系统,进口产品因经历了从半自动到全自动的发展过程,因此,半自动系统仍在临床微生物室应用。

此外,国产半自动微生物鉴定药敏系统在国内临床微生物室也有广泛应用,部分产品已开始出口销售到国外,这是国产医疗器械产品国际化的一个重要进步。 

一、国外相关质量标准

对于微生物的鉴定系统,临床微生物实验室期望对于少见细菌鉴定的准确率大于90%,对分离细菌的鉴定与常规方法相比准确率至少在95%以上。

根据美国1988年临床实验室改进修正案(CLIA’88),临床实验室报告患者的检验结果之前,需对试验方法和系统进行评价。对于评价一个新的鉴定系统,可遵循以下原则:

(1) 对参考方法或已选择的参比系统和待评价的系统同时进行试验；检测参考菌株(最少50株),持续1周,两种系统检测结果的符合率应在90%以上。存在差异的结果需要有参考实验室做出最终判断。

(2) 检测2～3种常见的已知标准菌株,进行50(小型实验室)～100(大型实验室)个检测。

(3) 选择20～50株病原微生物(覆盖12～15个不同的种)进行鉴定测试,测试结果应该和参方法或者已选择的参比系统结果相符合。

二、国内相关质量标准

对于微生物的药敏分析系统的评价与接受标准,根据《临床实验室检测和体外诊断系统感染病原体敏感性试验与抗菌剂敏感性试验设备的性能评价》(ISO 20771-2:2007)的第2部分“抗菌剂敏感性试验设备的性能评价”(国内YY/T-0688．2-2010等同采用),主要包括以下几个方面:

至少在3家不同的实验室进行评估,评估内容包括准确性、重现性和质控测试。

(1) 准确性评估:①选择不少于300株(如果系统预期仅用于一个属或种,则可减少至100株)与被评价抗生素相关的临床分离株；尽可能选择新鲜和(或)新近分离株,尽可能涵盖设备预期使用的属/种,尽可能包含对抗生素不同敏感程度的菌株；为了选择不同的耐药机制,可选择一定量的储存株作为补充。②接受标准:对以上菌株,待评估系统和参考方法需同时进行测试,总符合率(EA)≥90% ,且重大偏差(VMD)和次要偏差(MD)均应≤3%。

(2) 重现性评估:①选择不少于10株细菌,每次进行3次测试,时间不少于3天；②重复性≥95%。

(3) 质控量控制:在进行系统评价期间,需每天对质控菌株进行质控测试,至少有95%的测试结果应满足《临床实验室检测和体外诊断系统感染病原体敏感性试验与抗菌剂敏感性试验设备的性能评价》(ISO 20771-1:2007)的第1部分“抗菌剂对感染性疾病相关的快速生长需氧菌的体外活性检测的参考方法”(国内等同采用)中相关菌株质控范围的要求。

TC136体外诊断行业标准《微生物鉴定系统》已完成,进入报批程序,待批准发行后,其中性能评估部分可作为参考依据。

无论半自动还是全自动鉴定药敏分析仪,均要采取适当的质量管理措施。一般来说,鉴定药敏分析仪至少应包括如下内容:

1.日常室内质量控制　实验室操作人员应按仪器生产商要求进行日常室内质量控制,以评估仪器良好的工作状态。

2.仪器设备保养工作　实验室应按期进行规范的仪器设备保养工作,并做记录。

3.软件更新　 在厂商有新版本软件面市时,应及时进行更新,包括可鉴定的菌名,特别是CLSI药敏标准折点的调整,以满足临床诊断和治疗需求。