自动化血细胞形态分析仪

追溯外周血细胞涂片、染色、显微镜形态学检查的历史已有100多年，然而时至今日，这依然是临床上血液学检验须臾不可离开的手段。 现代医学检验技术获得了飞速的发展，如全自动生化分析、各种免疫学检测、核酸检测及各种现代的分子诊断技术广泛应用于临床，提升了临床医学的水平，促进了临床医学的快速发展。 但是，细胞形态学专家所进行的显微镜检查包括白细胞、红细胞、血小板形态学观察，白细胞分类和计数仍然是各专业临床医生进行疾病诊断、患者健康状况判断的基本依据。 从基层医疗机构到大型综合、专科医院，伴随着血液学分析24h不间断。 然而，外周血细胞涂片显微镜形态学分析目前还是一项人工操作为主、受主客观因素影响较多的技术。 直接与检验者知识水平、形态学领域工作经验、个人能力和工作状态、检测时环境因素等相关。 也与医院患者数量、病种，各实验室管理水平和人员培训情况，所使用的仪器、试剂，检测方法和实验室整体能力等客观因素相关。 显微镜的型号、推片技术、染液种类及浓度、缓冲液的浓度及pH、染色时间和温度及干燥方法等都会造成血细胞形态学分析结果的较大差异。 在细胞分类标准方面，技术人员间存在的主观差异性会导致结果的差异。 这些结果的差异直接影响临床医生的诊断和治疗，也有可能造成延误或错误。 因此，在实验室常规检验中迫切需要统一的、标准化的血细胞形态学分析手段和技术将细胞形态学检查这一人工操作技术提升到自动化、标准化和信息化，由此催生了自动化血细胞形态分析系统即血细胞形态分析仪的研究和发展。

早在1966年Prewitt和Mendelsohn发明了第一台用于血涂片图像分析的系统，命名为Cydac显微镜扫描系统(Cydac,乌普萨拉,瑞典)。 1974年Larc推出了第一台用于自动白细胞分类的仪器(CorningGlass)并投入临床使用，开创了白细胞五分类的先河。 同时PerkinElmer公司推出了Diff3,该系统可以将外周血细胞细分为10类，一次可以放入装有14张玻片的玻片盒。 GeometricDataCorp.公司推出的Hematrak是这些早期系统中最为成功的仪器，当时有超过1000家实验室在使用该系统。 该系统由一个机械移动载物台、飞点扫描仪和两台计算机组成，其中一台计算机用于形态学分析，提取细胞特征参数，另一台计算机为识别计算机，根据提取出的100种细胞特征参数进行统计和细胞分类。

这些早期的系统还存在一些问题，诸如:①相对较简单的计算机处理系统，对涂片染色质量要求很高，而推、染片还处在人工操作阶段；②数据库不够大，仪器所能自动辨识的细胞种类特别是异常细胞能力有限，依然需要人工实时分析。 ③忽略了白细胞内含物、红细胞及血小板的形态。 受到以上因素的限制，这些系统并没有在临床推广。

20世纪90年代末，随着高性能计算机技术的发展及双向通讯在医疗领域较为普遍的应用，数字图像在临床诊断中很快普及。 这种信息通讯首先在远程病理诊断领域开始应用，随后发展到血液学分析检测，所谓的远程血液学诊断也应运而生。该时期有三种自动细胞图像分析系统投入市场供临床使用， 分别是: MicroxHEG-50(Sysmex，日本)，Micro21-Model200(Beckman-Coulter,美国)和DiffMasterOctavia(CellaVisionAB,瑞典)。 MicroxHEG-50 由一个带有100×物镜的自动显微镜、自动滴油装置、一个3CCD照相机、一个图像分析单元和一个彩色显示器组成。 该系统可以一次性放入60张涂片，分别装载到15孔位的玻片盒。 系统运行分析的同时操作人员不能够查看图像及结果，只能在显示器上查看，系统电脑存储的图像及结果数量有限。 HEG系统因其在红细胞及血小板方面的功能不能满足其他地区实验室的需要，故只在日本的实验室使用。Micro21系统包括一个带有20×和100×物镜的自动显微镜、一个模拟照相机、自动滴油装置、玻片自动传输装置(4张涂片/ 玻片盒)和两台计算机，一次性最多可以放入13个玻片盒。Micro21可以预分类6类正常细胞、原始细胞和有核红细胞，并提供红细胞图像供形态学分析及血小板估算功能。 多个远程浏览工作站可以与分析仪器链接，但需要与主机保持在900m距离范围内。Micro21每小时可以分析20张样本。

1994年瑞典CellaVision公司创立研发出第一代系统DiffMasterOctavia系统。 该系统包括带有１００×物镜的自动显微镜、步进马达和光控单元、3CCD彩色照相机，以上组件链接到装有细胞定位及特征分析软件的系统计算机上。 该系统一次性可以分析8个样本，每小时可以分析20张玻片。 与早期的系统相比，DiffMasterOctavia是基于先进的人工智能网络(artificialneuralnetworks,ANN)对细胞图像进行运算分析，对经过瑞氏或瑞氏-吉姆萨或梅氏染色的外周血涂片均可进行分析，是第一个可以预分类15类细胞及6类红细胞特征形态的血细胞形态分析系统，也是第一个允许远程审核分析结果的系统，并且数据库中可以储存２ 万张样本图像结果。

该系统的成功，激励着瑞典CellaVision公司不断改进与研发更高性能的仪器， 在DiffMasterOctavia系统之后相继推出了DM8、DM96、DM1200、DM9600 等DM系列的仪器及ImageCaptureSystem，并且将应用领域从外周血细胞形态分析拓展到体液白细胞形态分析。 随着实验室对自动化的需求的不断提高，CellaVision公司与Sysmex公司合作，为Sysmex定制了整合到血液流水线的细胞形态分析仪-DI-60，并于2013年在欧洲投入临床使用。CellaVisionDM系列全自动细胞定位及预分类系统，不仅实现了从自动进样、自动滴加镜油、自动转换显微镜头、自动预分类细胞到结果自动存档的全自动化，还具有较高的细胞预分类准确性，实现了网络内的多系统互联，增进了专家间的协作。 目前，全球有2000多家实验室在使用CellaVisionDM系统进行常规细胞形态学检验，数字化细胞形态学分析领域的国际标准正在形成。 概括地讲，CellaVision全自动细胞形态分析系统给实验室的现有流程带来的帮助有一致性、协作性、互联性及人员能力的提升。 实验室血液学分析流程归纳为图3-1。

图3-1　实验室血液学分析流程

随着医学工作者对外周血细胞形态分析需求的不断增加，计算机系统、复杂的图像分析处理软件、计算机程序语言的进步，数字化细胞形态分析仪器又重新回到了医学实验室的日常工作中，为血液学分析提供有力的帮助。目前，得到美国FDA注册认证的自动化细胞形态分析仪器有两家:瑞典的CellaVision公司(DM系统)和美国的Medica Corp公司(EasyCell 系统)，其中CellaVision公司的ＤＭ系统是目前全球使用最为普遍的系统，主要仪器型号包括:DIFFMaster 、DM8、DM96、DM1200 及DM9600。此外，日本Sysmex公司与CellaVision公司于2013年合作推出了DI-60与Symex XN 系列血细胞分析仪整合的全自动流水线， 美国MedicaCorp公司的EasyCell系统主要在美国的少数实验室使用，除上述两种得到FDA注册认证的系统外，在其他国家地区也有类似功能的仪器：如德国 HornImaging GmbH 的 HemaCam，奥地利Westmedica 生产的 Vision Hema 和 TissueGnostics 生产的 Hemo-FAXS ，还有Mecos C2(Mecos,俄罗斯)和 HemaCyto (Clemex Technologies Inc ,加拿大) 等。 国内重庆天海医疗设备有限公司和北京赛尔蒂扶医疗科技有限公司和上海北昂医疗技术有限公司等也在努力研发该类技术产品，并分别有BCM-2 和CMIS 型细胞医学图像分析系统获得CFDA 医疗器械注册证用于临床。2011 年北京赛尔蒂扶( Celldiff )医疗科技有限公司在我国研发出了全自动血细胞形态分析仪(BCM-1)，并于2012年在技术上进行了改进和完善推出了第二代产品( BCM-2 )。目前已研发生产了 BCM-2 、BCM-3 型血细胞形态分析仪(Blood Cell Morphology Analyzer)等系列产品。以其自动化设计、批量化操作、友好人机界面、专业数据库管理及强大数据分析等优势，让枯燥、繁冗、低效的显微镜检工作变得轻松、直观、高效。

（一）DM全自动数字化细胞形态分析系统的检验项目

１. 外周血白细胞可报告类别　包括杆状中性粒细胞、分叶中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、原始细胞、异型淋巴细胞、浆细胞、未成熟嗜酸粒细胞、未成熟嗜碱粒细胞、幼单核细胞、幼淋巴细胞、大颗粒淋巴细胞、毛细胞、赛塞利细胞。 结果以百分比(％ )报告。除上述软件自带白细胞类别外，用户还可以根据需要自定义添加10类白细胞名称。 另外，还允许用户将本实验室样本中的细胞图像添加到仪器的参考细胞图库中。

２. 外周血红细胞可报告类别　包括嗜多色性红细胞、染色过浅、红细胞大小不等、小红细胞、大红细胞、红细胞异型、裂细胞、盔形红细胞、镰刀形红细胞、球形红细胞、椭圆形红细胞增多症、卵形红细胞、泪滴形红细胞、口形红细胞、刺状红细胞增多症、棘状红细胞增多症、Hoeell-Jolly小体、含铁小体、嗜碱性点彩、寄生虫等。 结果以程度级别报告:０、1+、2+、3+。 此外，仪器还会显示红细胞单层整体预览图。除上述软件自带红细胞细胞类别外，用户还可以根据需要自定义添加10 类红细胞名称。另外，DM 全自动细胞形态分析系统还可对非白细胞进行预分类，类别包括:有核红细胞，巨大血小板、血小板聚集、涂抹细胞、碎片。

３. 外周血血小板估算　操作员可以在仪器软件界面进行血小板估算。

４. 体液白细胞可报告类别　该部分为可选功能，包括中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸粒细胞、巨噬细胞、其他(肿瘤细胞、原始细胞等)。 系统对整个样本区域进行图像拍摄并成像，操作人员可以对样本感兴趣区域进行标记备注。 除上述软件自带细胞类别，用户还可以根据需要自定义添加10类白细胞名称。可分析的体液样本包括:脑脊液、心包液、胸膜液、腹膜液、腹腔液、支气管肺泡灌洗液。

５. 数字扫描功能　DM 系统还可以用来对组织样本用户指定区域进行电子显微镜扫描，添加备注，并保存数字图像。

６. 样本数字化保存　仪器运行的样本结果可以数字化保存在系统电脑，当数据库饱和时还可以扩展保存到外接移动硬盘上，并且随时可以查看以往分析结果。

７. 样本信息　样本信息可在软件界面进行编辑，如病人姓名、年龄、性别、备注等。 另外，系统软件可以通过中间软件与血细胞仪进行通讯连接，DM系统软件界面上可以显示样本血细胞仪结果。

（二）BCM 全自动血细胞形态分类识别系统的检验项目

１. 白细胞分类　包括白细胞计数总数、中性杆状核粒细胞数目、中性杆状核粒细胞百分比、中性分叶核粒细胞数目、中性分叶核粒细胞百分比、淋巴细胞数目、淋巴细胞百分比、单核细胞数目、单核细胞百分比、嗜酸粒细胞数目、嗜酸粒细胞百分比、嗜碱粒细胞数目、嗜碱粒细胞百分比、原始细胞数目、原始细胞百分比、早幼粒细胞数目、早幼粒细胞百分比、中幼粒细胞数目、中幼粒细胞百分比、晚幼粒细胞数目、晚幼粒细胞百分比、异型淋巴细胞数目、异型淋巴细胞百分比、浆细胞数目、浆细胞百分比、涂抹细胞数目、涂抹细胞百分比、有核红细胞数目、有核红细胞百分比、巨血小板数目、巨血小板百分比。

２. 白细胞形态　包括中性粒细胞分叶指数、核左移/ 核右移、中性粒细胞中毒颗粒指数、平均面积、面积变异、平均直径、直径变异。 其中中性粒细胞分叶指数、核左移/ 核右移、中性粒细胞中毒颗粒指数为BCM系列特有参数。

３. 红细胞分类　包括红细胞计数总数、正常红细胞、巨红细胞、大红细胞、小红细胞、低血红蛋白红细胞、低血红蛋白小红细胞、高血红蛋白红细胞、球形红细胞、椭圆形红细胞、泪滴形红细胞、棘形红细胞、靶形红细胞。

４. 红细胞形态　包括平均面积、面积变异、平均直径、直径变异、形态不整、大小不均。

５. 血小板分类　包括巨、大、中、小血小板，重度、中度、轻度、可疑凝集。

６. 血小板形态　包括平均面积、面积变异、平均直径、直径变异、血小板浓度水平、血小板凝集度、血小板/ 红细胞、大小不均。

（一）仪器使用前的安装调试与性能验证

１. 仪器验收　安装前要与设备管理部门一起对仪器进行开箱验收，包括仪器外观完整性和仪器配置清单与购买合同的一致性，然后按照配置清单逐一清点验收。

２. 仪器安装　选择避免阳光直射、干燥、方便开展工作、平整的地面或桌面安装。

３. 仪器调试　按仪器说明书接通电源，连接所有通讯端口，安装仪器扫描和细胞分析软件、添加专用镜油至红线以上。排除镜油管路中的空气，在扫描程序中设置需扫描的区域或细胞数。将预先准备好贴有条形码的血片装载入专用片盒中，放入仪器待检区，仪器便自动进行扫描，观察结果传输是否正常、扫描细胞清晰度、白细胞分类结果和红细胞识别情况。

４. 仪器性能验证　

(１) 性能验证内容:至少包括扫描细胞的清晰度及与镜下细胞的差异程度、白细胞分类计数的不精密度、可比性(相关性)和生物参考区间。

(２) 扫描细胞:清晰度与镜下细胞差异程度，扫描细胞胞质、胞质颗粒、核染色质、核仁等应清晰可见可辨，与镜下细胞色差小。

(３) 白细胞分类计数不精密度:取正常血片和粒细胞增多或左移(杆状核)、单核细胞增多、嗜酸粒细胞增多、嗜碱粒细胞增多、淋巴细胞增多或异型淋巴细胞、粒细胞减少、淋巴细胞减少、幼稚细胞及有核红细胞的血片各1份，每片重复扫描检测20次，分析白细胞分类计数结果。标准差 s=p×q/n  ，p=某种细胞的百分比。q=100-p ，n=计数细胞数。95％ 的结果应在均值±2个标准差范围内。

(４) 白细胞分类计数结果的可比性:选择100个正常人和100个包括粒细胞增多或左移、单核细胞增多、嗜酸粒细胞增多、淋巴细胞增多或异型淋巴细胞、粒细胞减少、幼稚细胞和有核红细胞的病人.各制备血片2 张.先交由不知样本来源具有形态学检验资格且经验丰富的2位检验人员进行白细胞分类计数.每人每张血片分析200 个细胞.记录各类细胞结果A 和B.然后由仪器进行检测分析.每张血片检测分析200 个细胞.记录各类细胞结果C 和D.比较Ｃ 和Ｄ 的均值与A 和B 的均值之间的差异.如果C和D的均值在A 和B 的均值理论上95％ 可信区间.则认为仪器法结果与参考方法结果可比.或两均值经配对t检验.应无显著性差异.

(５) 生物参考区间:取20份正常人血片.分析仪器检测分析结果.95％ 的分析结果应在仪器厂商推荐的生物参考区间内.

５. 仪器性能验证的步骤　

(１) 人员培训:包括血片制备、染色、仪器扫描范围的选择、扫描程序的选择、仪器的操作、维护保养、故障排除、结果统计分析等。

(２) 操作规程:根据仪器使用说明书撰写仪器操作使用、维护保养SOP、仪器校准SOP、室内质量控制SOP、人工复核、人工镜检SOP。

(３) 按要求进行仪器性能验证试验。

(４) 根据性能验证试验结果.书写性能验证报告交设备管理部门归档。

（二）设备管理部门

(１) 对仪器进行唯一性标识并根据仪器性能验收报告给予仪器状态标识，包括仪器名称、品牌、型号、购买日期、安装日期、校准日期、下次校准日期、校准单位等信息。

(２) 根据仪器维修、校准响应时间，维修、校准后使用部门的反馈信息(返修率、校准内容和报告的完整性等)等做好供应商评价工作，以供再次购买仪器时参考。

（三）仪器使用部门

１. 仪器开始使用前　做好相关人员培训工作，包括血片制备、染色方法、标签的粘贴、室内质量控制、仪器软件的使用、扫描区域和顺序的设定、简单故障的排除等。

2 . 仪器使用中　

(１) 检测人员应根据SOP做好仪器开机、关机、质控、日常维护保养和仪器状态监测工作，并做好记录。

(２) 室内质量控制:推荐使用1张正常人、1张有感染中性粒细胞增多、1张有异型淋巴细胞、1张有有核红细胞、1张有幼稚细胞且制片染色质量良好的血片进行日常仪器的状态监测，每天至少检测1次，可根据医院患者人群分布选择不同的质控片进行质控，取不同的质控片每年1月前20天每天上下午各测1次，完成初始化，分别计算各自的均值和s，用来控制当月剩下工作日的质控，推荐使用13s质控规则，1月结束后将所有结果重新统计计算均值和s，用来控制2月份质控，待2月结束后，将1、2月份所有数据重新统计计算均值和s，用来控制3月份质控，待3月结束后，将1、2和3月份数据重新统计计算均值和s，用来控制全年剩余月份的质控。 室内质控有失控时，应停止检验，分析查找原因，采取纠正措施进行纠正并进行验证，对失控前筛检结果的有效性进行验证并做记录，失控纠正后方可继续检测分析。

(３) 人机比对:每半年应组织1次人机比对，每次至少使用10个病例的血片，至少包括1例中性粒细胞增多、1例有异型淋巴细胞、1例有幼稚细胞和1例有有核红细胞的血片，由仪器分析后再由1位有资格、经验丰富、不知样本来源的检验人员分类，按细胞类别分别记录结果为A和B，比较A和B之间的差异，A应在B 值理论上99％ 可信区间内，若人机比对有不符合，应分析查找原因，寻找可能改进的机会。

(４) 仪器故障:做好仪器故障和停用标识，以免误用，并向设备管理部门提出仪器请修申请，由设备管理部门联系厂家工程师进行维修，一般故障维修结束后工程师填写维修报告，由使用部门签字确认，保存维修记录；如故障比较严重，需要更换零部件，则需有设备管理部门到场确认更换零部件事宜；如果更换的零部件属关键部件，有可能会影响检测结果，维修结束必须进行仪器校准和校准验证，填写仪器维修报告和校准报告，由设备管理部门和使用部门共同签字确认，保存维修和校准记录，并由设备管理部门对仪器状态重新进行标识。

3 . 仪器使用后　

(１) 结果审核人员要结合血细胞分析仪报警信号、血细胞分析仪扫描细胞分析情况、患者情况、临床诊断等信息综合考虑是否需要进一步人工镜检和直接进行仪器结果报告审核工作。

(２) 做好仪器的期间核查工作，以检查仪器两次校准期间是否存在聚焦等方面的偏移。

(３) 根据仪器使用情况及法规和标准等要求制订仪器校准计划，校准计划至少应包括校准内容、用于校准的物质名称、有效期、校准单位、校准周期等。 制订好的校准计划应交设备管理部门组织实施。

(４) 根据校准计划对校准后的仪器和校准报告进行核查并签字确认。