核酸提取仪及PCR仪

一、核酸提取仪发展简史

1952年,奥地利裔美国生物化学家查伽夫(E. Chargaff)测定了DNA中4种碱基的含量,发现其中腺膘呤与胸腺嘧啶的数量相等、鸟膘呤与胞嘧啶的数量相等。这使Watson和Crick立即想到4种碱基之间存在着两两对应的关系,形成了腺膘呤与胸腺嘧啶配对、鸟膘呤与胞嘧啶配对的概念。

1953年,Watson和Crick DNA双螺旋结构的发现,开启了分子生物学时代。分子生物学使生物大分子的研究进入一个新的阶段,使遗传学的研究深入到分子层次。对DNA的提取成为生物医药领域甚至农林牧渔等领域内所有学科科学研究的基础,随着基因诊断、转基因食品检测、个性化医疗等的快速发展,核酸提取技术也伴随着向前快速发展。

虽然不同生物DNA的提取方法不尽相同,但各种提取方法也有很多相通之处,可以相互借鉴。随着生物技术的飞速发展,对这一技术的经验总结将会越来越多,一些生物领域新的DNA提取方法也将逐渐固定下来,更为简捷、高效的方法也必将出现,为基因工程提供更高纯度的DNA,随着基因诊断、转基因食品检测、个性化医疗等的快速发展,现在的核酸提取技术已经不能满足当今生物技术发展的需要,急需高通量、自动化的核酸提取方法。在这种背景下,柱膜法与磁珠法核酸提取试剂相应出现,然而,刚开始并没有全自动提取仪,而是借助离心机、磁力架完成核酸提取,随着市场需求与科技的发展,提取仪应运而生。

二、PCR技术发展简史

聚合酶链式反应(PCR)是一种能够进行快速DNA复制的分子生物学技术,能够使微量的遗传物质在数小时内得到几百万倍的扩增。自发明以来,PCR技术已经彻底改变了基础研究和医学诊断的方法。

1983年Cetus公司的K． Mullis在这年底(12月16日第一次成功实验)发明了PCR。

1985年关于PCR的文章首次由Cetus公司的Saiki等在Science上发表。

1987年当年7月Cetus公司在美国获得PCR基本技术专利批准。1985年底成立的Perkin-ElmerCetus仪器公司(PECI)于这一年的11月推出了第一个PCR试剂产品及第一台热循环仪。

1989年Science报道了耐热性DNA多聚酶Taq酶的发现,预示着分子时代的到来。12月Science杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。Hoffmann-La Roche公司和Cetus开始合作将PCR应用于临床诊断。

1990年Cetus科学家D．Gelfand和S．Stoffel发明了纯化 TaqDNA多聚酶的方法。Cetus科学家H．Erlich和K．Mullis在德国临床化学领域获得生化分析奖。

1991年实时荧光PCR技术——TaqMan技术发表。当年11月 Hoffmann-La Roche公司从Cetus获得全球的PCR专利权。Roche Molecular Systems创建了单一耐热多聚酶rTth进行RT-PCR技术,并用于临床RNA病毒检测。同年耐热反转录酶首次由Cetus科学家发现并报道。

1992年当年3月Cetus公司获得Taq酶、热循环扩增仪等专利。

1993年Kary Mullis因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。

1998年实时荧光PCR技术开始在中国较广泛地应用于临床检测。

1999年西方发达国家尝试将PCR应用于血液筛查。

回顾分子生物学的发展历程,PCR技术的发明 和普及无疑是最重要的篇章之一。而PCR技术在近30年的不断发展创新中,最受瞩目的当属荧光实时定量PCR技术(real-time quantitative PCR,或qPCR)。定量PCR技术真正实现了PCR从定性到定量的飞跃,通过对PCR过程的实时监控,专一、灵敏快速、可重复地精确定量起始模板浓度,已经在科研和临床诊断领域得到了越来越广泛的应用。 

1．核酸提取仪 核酸提取仪是应用配套的核酸提取试剂来自动完成样本核酸提取工作的仪器。核酸提取仪是近几年才得到应用推广的仪器,是用于核酸提取的自动化仪器。核酸提取仪的目标用户:对标准化、质量改进和自动化感兴趣的分子诊断和研究实验室,涉及核酸提取实验的小型、中型和大型实验室。

核酸提取仪器一般分为两大类:一类是自动液体工作站,另一类是小型的自动化仪器。

自动液体工作站是功能非常强大的设备,液体分液、吸液等自动完成,甚至可以整合扩增、检测等功能,实现标本提取、扩增、检测全自动化。提取核酸只是其功能的一个应用,不太适合常规实验室提取核酸,一般都应用在单一类标本并且一次提取标本量非常大(至少96个,一般几百个)的实验需求上。自动工作站的平台建立及平台的运作,需要比较大的资金。

小型的自动化仪器是通过运行结构的特殊设计来达到自动提取核酸的目的,可以在任何实验室得到应用,最近几年有很多机型陆续投放市场。

根据应用的试剂不同,又分为两类:一类是应用磁珠法试剂的仪器,另一类是应用离心柱法试剂的仪器。柱膜法的自动化提取仪因为设备成本高,适合一次提取样本较少且同一类样本,所用的试剂比较封闭；而磁珠法核酸提取仪,提取样本数量较高,提取试剂为开放式,适合规模化全自动操作。应用磁珠法的自动核酸提取仪操作简便,容易自动化,是目前市场上的主流仪器。

柱膜法采用的离心吸附柱硅基质材料为特有新型材料,能够高效、专一吸附DNA,可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物,可以特异性结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲液系统,样品裂解后,DNA在高盐条件下与硅胶膜结合,在低盐、高pH时DNA从硅胶膜上洗脱下来。

依据与硅胶膜离心柱相同的原理,磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠,这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团,能同核酸发生吸附反应。硅磁(magnetic silica particle)就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料来吸附核酸,其纯化原理类似于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料(如 DEAE、COOH)等,从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散,从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。磁珠法核酸自动提取仪一般可分为磁棒法和抽吸法两种。

抽吸法,也叫移液法,就是通过固定磁珠、转移液体来实现核酸的提取纯化,一般通过操作系统控制机械臂来完成移液。

移磁珠法,即通过磁珠的转移来实现核酸的分离纯化,一般通过仪器里磁棒的运动,来实现磁珠从样本裂解液、结合液到洗涤液,再到洗脱液的转移,从而自动完成核酸分离与纯化的全过程。其过程与原理包括以下几个步骤:①裂解吸附。在含磁珠的裂解液中加入待处理样品,充分混合,裂解细胞(适当加热有助于细胞的裂解),释放的核酸在高盐低pH下特异性地吸附到磁珠上,而蛋白质等分子则不被吸附而留在溶液中。②洗涤。在磁棒的磁场作用下,磁珠与溶液分离,磁棒将磁珠转移至洗涤缓冲液中,经过反复洗涤,去除蛋白质、无机盐等杂质。③洗脱。洗涤结束后,磁棒又将磁珠转移至洗脱缓冲液中,在低盐高pH下核酸从磁珠上被洗脱下来,最后磁棒又将磁珠移出,即完成核酸的全部提取。

2．PCR仪  PCR技术是20世纪80年代中期由美国Cetus公司Mullis等发明的一种可快速实现体外基因扩增的技术。该技术由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个循环,经多次循环,达到使目的DNA被迅速扩增的目的,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。普通PCR仪也称为基因扩增仪,实际上相当于一个高效率地温控系统,能够在短时间内高效率地切换PCR酶反应所需要的温度。该仪器主要应用于实验研究、医学临床、检验检疫等领域。

根据功能不同可分为三大类:

(1) 普通PCR仪:一次扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪,也称为传统PCR仪。主要用于已明确退火温度目的基因的扩增。如果要用来做不同退火温度的扩增,以摸索目的基因适合的退火温度,则需要多次运行。

(2) 梯度PCR仪:带梯度PCR功能的基因扩增仪,在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化。根据结果,一步就可以摸索出最适合的反应条件,既节省实验时间,提高实验效率,又节约实验成本。梯度PCR仪,在不设置梯度的情况下也可以做普通PCR扩增。

(3) 原位PCR仪:是由普通PCR仪衍生出的带原位扩增功能的基因扩增仪,用于对细胞内靶DNA的定位分析,如病原基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。PCR反应体系渗透到组织和细胞中,在细胞内靶DNA所在的位置上进行基因扩增,既能检测到靶 DNA,又能标出靶序列在细胞内的位置。整个过程保持了细胞或组织的完整性,可在分子和细胞水平上研究疾病的发病机制和临床过程及病理的转变。

PCR仪本质上就是一种可实现精确温度控制的仪器。随着科技的不断进步,PCR扩增仪经历着以下几种温度控制方式上的变化:

(1) 水浴锅PCR仪:属于第一代PCR基因扩增仪,用不同温度的水浴锅串联成一个控温体系,并通过机械臂操作将试管移动到不同的水浴来改变反应的温度。该机温度可调、恒温精度高、温度均匀、价格低廉,适于基层实验室使用,其缺点是自动化程度低,机械臂易出故障,移动过程耗时多,移动的过程中容易导致非特异性产物的产生。

(2) 压缩机PCR仪:属于第二代PCR基因扩增仪,由电阻丝加热升温、压缩机制冷降温。控温方式比第一代PCR基因扩增仪方便,但压缩机故障率高且控温效果不佳,比如存在严重的边缘效应及稳度overshooting现象。

(3) 半导体PCR仪:属于第三代PCR基因扩增仪,由半导体自动控温,金属导热。该机体积小,升降温速度快,检测样品通量大,样品基座温度准确、均一性好,自动化程度高,扩增程序容量大,操作简单、方便,检测结果稳定可靠性高,是目前国内外生产和使用较为普遍的PCR基因扩增仪。 

(一) 国标

《聚合酶链反应分析仪》(标准编号:YY/ T1173-2010),实施日期2012年6月1日。

本标准规定了聚合酶链反应分析仪的术语和定义、分类和命名、要求、试验方法、标志和使用说明书、包装、运输和储存等内容。

本标准适用于对核酸样本进行扩增、检测、分析的PCR仪。

本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。

本标准是评价聚合酶链反应分析仪产品质量的依据。

本标准由全国医用临床检验实验室和体外诊断系统标准化技术委员会(SAC/TC 136)提出。

本标准由全国医用临床检验实验室和体外诊断系统标准化技术委员会(SAC/TC 136)归口。

(二) 国外标准

核酸提取仪和PCR仪注册时需要满足《体外诊断医疗器械指令》98/79/EC中规定的保护要求。指令不含具体的技术要求细节,其技术要求由标准支撑。

目前欧盟对核酸提取仪和PCR仪申报CE认证时需要按照以下两个国际电工技术委员会(IEC)标准要求进行符合性检验:

(1)《测量、控制和实验室用电气设备的安全要求——第1部分:通用要求》(Safety Requirements for Electrical Equipment for Measurement,Control,and Laboratory Use—Part 1:General Requirements),编号IEC61010-1/EN 61010-1-2001。

(2)《体外诊断医疗设备特殊要求》[Particular Requirements for in Vitro Diagnostic (IVD) Medical Equipment],编号IEC 61010-1/EN 61010-2-101-2002。

有些厂家还对部分仪器同时参照UL 61010-1和CAN/CSA C22.2 No.61010-1进行验证。目前尚无针对核酸提取仪和医用PCR扩增仪的特殊仪器性能强制检测要求。

美国对分子诊断产品按检测项目管理,FDA并不单独批准某个PCR仪为医疗器械。在批准一个新的分子诊断检测试剂时,FDA会在批准文件中明确该试剂的适用PCR机型。

美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology,NIST)直属美国商务部,其主要任务是包括建立国家计量基准与标准、提供计量检定和校准服务、参加标准化技术委员会制定标准。市场上供应的许多开放型科PCR仪,都符合NIST校准标准或可溯源到NIST的温度校准。

核酸提取及PCR技术应用范围广泛,包括肿瘤基因检测、微小残留病变的检测、细胞因子的表达分析、病原体感染表达的检测等。

1.肿瘤基因检测 肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化,是一种多基因异常的疾病,这些异常变化可以用实时荧光定量PCR法检测出来。该技术不但能有效地检测基因的表达变化,且能准确监测其表达量,可据此进行肿瘤的早期诊断、分型、预后判断及个体化治疗的指导。目前用此方法可进行端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病bcr /abl融合基因、肿瘤MDRI基因、白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测；结直肠癌组织细胞中KRAS基因外显子2中第12、13编码子上的8种基因突变的检测；非小细胞肺癌组织细胞中EGFR基因突变和ALK基因的断裂融合的检测等。

2.微小残留病变的检测 目前,由于医疗手段的进步及抗肿瘤药物的应用,肿瘤患者的生存期已有所延长,于是缓解期患者肿瘤复发的危险就凸显出来,因此,微小残留病变(minimal residual disease,MRD)的检测对于进一步调整治疗方案至关重要。Real-timePCR技术正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种重要工具。尤其是血液的恶性肿瘤常伴有特异性基因的易位,它常可以作为监测临床治疗效果的一种标志。白血病复发的主要根源是患者在缓解期体内仍有微量残留的白血病细胞(10-5～10-6),用传统的形态学方法无法检测,Real-timePCR对MRD的检测比染色体、流式细胞仪检查方法更敏感,比普通的PCR特异性更强,能更有效解决PCR污染问题；尤其是通过动态定量监测,比单次阳性结果更有意义。同样的方法也被用于定量其他的易位融合基因水平,如慢性粒细胞性白血病(CML)的bcr/abl融合基因等。

3.细胞因子的表达分析 细胞因子在体内作为一种调节蛋白,由各种细胞分泌的低分子量的蛋白质组成,其表达和分泌受体内严格的调控。能分泌细胞因子的细胞类型很多,如淋巴细胞、抗原提呈细胞、单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞等。细胞因子可被分为不同的组:白细胞介素(白细胞介素1～23),干扰素(干扰素α、干扰素γ等),集落刺激因子,肿瘤坏死因子,转化生长因子(转化生长因子β等)和化学因子(单核细胞趋化蛋白1、巨噬细胞炎症蛋白1等)。在某些病理状态下,细胞因子的表达会出现异常,主要表现为细胞因子及其受体的缺陷、表达过高及可溶性细胞因子受体的水平增加等,通过 real-timePCR来对细胞因子的mRNA进行定量,来反映其蛋白表达量,从而可以对一些疾病进行诊断和研究。

4.病原体感染表达的检测 扩增技术的发展使得对病毒的定性或定量检测的能力随之提高,也使研究病毒的负荷和疾病进展的关系成为可能。目前运用较多的是在器官移植中对使用免疫抑制剂的患者用实时荧光定量PCR来定量测定巨细胞病毒(CMV)感染。研究表明在骨髓移植的患者中用实时荧光定量PCR检测巨细胞病毒感染比传统的pp65抗原试验更敏感,抗巨细胞病毒药物治疗能使血中的病毒含量下降。目前,用此方法还可以对结核分枝杆菌、免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、巨细胞病毒、EB病毒、淋球菌、沙眼衣原体、人乳头瘤病毒等病原体进行准确的定量检测。 

(一) 临床PCR实验室相关管理规范

根据卫生部2002年1月14日发布的卫医发[2002]10号《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》及其附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》,以及同年2月20日卫生部临床检验中心发布的《临床基因扩增实验室工作规范》,明确规定了临床基因扩增检验实验室开展PCR技术必须具备的条件。

2010年12月16日卫生部对《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发〔2002〕10号)进行了修订,制定了《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》。

(二) 核酸提取仪管理要求与程序

1．仪器安装及注意事项　

考虑到仪器的安全性和性能方面的原因,安装核酸提取仪的环境应该满足以下条件:

(1) 非爆炸性环境；正常的大气压(海拔高度应该低于3000m),环境温度20～35℃,典型使用温度25℃；相对湿度从10%到80%；畅通流入的空气应该是35℃或以下。

(2) 避免仪器接受过多的热量和意外溅入的液体(不要将仪器放置在靠近热源的地方,如电暖炉,同时为防止电子元件的短路,应避免水或者其他液体溅入其中)。

(3) 供应空气要求:核酸提取仪需要充足的35℃以下的空气供应,以便散去仪器内的热量。进风口和排风口均位于仪器背面。如果空气供应不充足或空气温度过高,则会导致仪器运行故障甚至自动死机。请确保足够的空气供应:不要堵住进风口,核酸提取仪离其他竖直面至少10cm,远离其他热循环仪或产热的仪器,避免灰尘或纤维在进风口聚集。

(4) 仪器接地:为了避免触电事故,仪器的输入电源线必须可靠接地。本仪器使用的是三芯接地插座,这种插头带有一个第3(接地)脚,只能配合接地型电源插座使用,这是一种安全装置。如果插座无法插入插座内,则应请电工安装正确的插座,不要使接地插头失去安全作用。

(5) 远离带电电路:操作人员不得擅自打开仪器。更换元件或进行机内调节必须有持证的专业维修人员完成。不要在连接上电源的情况下更换元件。

2．操作防护与限制措施　

(1) 操作前防护:完整阅读本手册,内有操作本仪器的必须信息。安装:本仪器应该按照第1部分的要求拆箱、安装。核酸提取仪三相电源输入端、接地端必须可靠地连接到大地。

(2) 操作中防护:机器在运行的过程中严禁打开核酸提取仪的门,否则会造成仪器的永久损坏；运行时,样品室加热器表面有高温,严禁触及；任何时候打开机器外壳时,必须切断电源。

1) 保证风道畅通:仪器利用空气进行加温和降温,必须保证进出风孔的通畅,如有灰尘可用软毛刷、湿布或真空清洁器来清洁。如果这些孔被灰尘或纤维堵塞,机器会出现加热和排风障碍,从而导致相关的性能故障。

警告:为防止风道的堵塞,一定要经常检查进出风口的灰尘累积情况。

2) 危险因素

A．样品的污染:由于该仪器多用于检验具有污染性的样品,所以仪器必须放在PCR实验室里工作,操作者在操作的时候必须遵循PCR实验室的相关规定,穿戴好防护服、防护手套等,做好相关防护措施。

B．电力:确认使用和核酸提取仪一起随机的电源线；只能将主电源插头插入有地线保护的电源插座。不能使用一条没有保护地线的扩展线；不要在切断主电源之前更换保险丝；确保只使用实验所要求电流和特定型号的保险丝,禁止使用替代的保险丝和短路保险盒；当仪器接通电源后,打开外壳或移走部件会造成人员伤害,因此在进行任何调整、替换、保养或维修之前,切断所有的电源。

C．缺陷与异常情况:每当保护性措施可能已经受损时,应停止使用仪器并确保无任何无意识的操作。如果该仪器出现以下情况,则保护性设施可能已经受损:有可见的损伤；不能进行预期的工作；运输压力过重,承载过重的压力。

(3) 日常、定期维护:实验结束后,关闭仪器供电电源,可以使用75%乙醇(或仪器指定使用的清洁剂)对实验舱进行清洁,请勿使用漂白剂或试剂含有酸、碱金属或研磨剂清理,请使用脱脂棉进行擦拭,待乙醇晾干后,开启紫外灯照射30min以上进行消毒,根据仪器操作说明书进行定期维护。

(三)PCR仪管理要求与程序

PCR仪属于精密仪器,除了按照常规仪器要求远离水池、强磁场等干扰源外,PCR仪对运行环境温度和湿度有一定要求。实验室人员因仔细阅读仪器使用说明书,了解对环境温度、湿度的要求。室温过高或过低都会引起仪器内部的电子元件工作异常。PCR仪应放在通风良好的地方,易于扩增过程中散热,保证仪器温度循环工作正常。

通常仪器的定期校准由仪器厂家进行。厂家应有校准SOP,工程师参照SOP完成相应的校准程序,签发校准结果。

1．新仪器装机 以cobas TaqMan仪为例,新仪器硬件安装、连接完毕,应运行仪器“首次开机初始化”,然后运行一个“模拟工作程序”(Run In)。流程如下:

(1) 打开软件,选择并运行“首次初始化”；仪器进行管路清洗和机械臂定位。

(2) “首次初始化” 运行结束后,选择并运行“模拟工作程序”。“模拟工作程序”是一个小规模模拟实验流程,运行期间有机械臂的各种功能运动、热循模块升降温等,相当于验证了一个完整试验流程的各项功能。

(3) “模拟工作程序”运行完毕,软件系统提示结果“通过”。

2．每日维护

(1) 关机。

(2) 清洁仪器盖板内表面(先用蒸馏水,然后用70%的乙醇溶液)。

(3) 擦拭热盖周围所有可及的表面(先用蒸馏水,然后用70%的乙醇溶液)。

(4) 清洁仪器内部定位柱和机械臂(先用蒸馏水,然后用70%的乙醇溶液)。

(5) 清洁仪器表面及周围的部分,仪器的背面无需此清洁。

(6) 清洁放置仪器的试验台表面。

3．定期维护

(1) 普通保养:分为周维护、月维护等。到期时,开机软件即自动提示,包括仪器表面清洁、样针定位、长时间管路冲洗等。

(2) 零配件更换:损耗性零配件有固定的使用期限。系统自动记录使用时间和频率,提前通知操作人员准备更换。

(3) 年度保养/校准:需要使用专门的维护保养软件,由罗氏工程师完成。按照规定的SOP逐个核查,记录操作和检测结果,签发报告。主要程序和内容包括:

1) 检查仪器外观和部件是否齐全,是否有缺失、损伤。

2) 检查系统所用软件版本是否正确；仪器操作说明书是否在方便查阅的位置。

3) 光路校准:使用配套定标试剂盒,按照说明书指示运行定标试验,对光路系统进行检测,软件判断检测结果是否合格,记录定标试剂盒产品编号/批号、检测结果。

4) 热循环系统检测:运行热循环系统校准软件,系统记录并判定检测结果。