分子杂交仪及芯片设备

生物芯片(biochip)技术是20世纪90年代初随人类基因组计划而出现的一项高新技术,因其具有与计算机芯片类似的微型化、高通量分析和处理大量生物信息的特点而得名。作为高度集成化的分析技术,它的出现和应用引起国际上的广泛关注,Science把生物芯片评为1998年度十大科技突破成果之一。经过30多年的发展,生物芯片技术已取得重大进展,成为生物学研究的一种重要技术手段,并逐步发展为实验室中的常规实验技术,也显示出良好的市场应用前景。

基因芯片的本质是核酸杂交技术的集成化、微型化,其技术来源可以追溯到20世纪。

Edwin Southern于1975年发明了一种简单有效的、具有里程碑意义的DNA分子杂交分析方法,因而以其姓氏命名,被称为Southern印迹杂交(Southern blotting)技术。利用该技术可以检测在基因组中某一特定基因是否存在及其大小、数量等,被广泛应用于遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等。

随着生物技术的迅猛发展,到20世纪人类基因组计划基本完成时,人们就已经得到了大量的基因序列信息。因此,迫切需要一种新的方法,能以大规模、高通量的方式同时对成千上万个基因的表达状况进行研究,大规模地研究基因功能。此时常规的分子杂交方法已经不能适应上述要求,基因芯片技术由此应运而生。

基因芯片技术是20世纪90年代初由斯坦福大学的Schena教授及其同事研究出来的。该技术的诞生得益于斯坦福大学深厚的核酸化学研究基础,包括从20世纪50～90年代发展起来的DNA多聚酶、重组DNA、滤膜阵列和基因表达分析等多个领域的相关技术。基因芯片技术主要结合了六门学科的内容,它们是生物学、化学、物理学、工程学、数学和计算机科学,要求多学科共同发挥作用。

在20世纪70年代,斯坦福大学的研究者们研究了基于硝酸纤维素膜和尼龙膜的许多应用途径,这些方法为20年后微阵列技术的建立提供了基本的理论基础。1975年,斯坦福大学的Crunstein和Hogness发表了第一篇描述DNA阵列的论文。作者采用了硝酸纤维素膜点上细菌克隆的方法来分离果蝇基因。随后斯坦福大学的其他研究人员也进行了类似的研究工作。

20世纪90年代早期,花菁染料(cyanine)被用于DNA探针的制备过程。Pinker及其同事在20世纪80年代和90年代早期发明了双色标记和检测方法用于染色体分析。以上在荧光标记核酸和荧光显微镜方面所做的工作为现在微阵列技术中的荧光标记和检测奠定了基础。

20世纪80年代晚期和90年代早期研究人员在玻璃片上进行了早期的核酸杂交反应。1989年莫斯科的Mirzabekov及其合作者,1991年Affymetrix公司(昂飞公司)的Fodor及其合作者,1992年牛津大学的Maskos和Southern等,都进行了这方面的工作。

在Imperial Cancer Research Fund(ICRF)工作的Hans Lehrach及其同事在20世纪80年代后期开创性地把机械手用于DNA阵列的快速制备。他们的工作为后来高精度运动控制系统广泛用于光引导原位合成、接触式点样和喷墨式点样奠定了基础。

真正使基因芯片技术发展并实用化的当数两项关键技术的发明。

其一是机械手点样技术的使用,它使得微量DNA荧光检测技术的实现成为可能。采用高精度的机械手(类似于机器人)或其他连续点样技术便可将几万个DNA样品均匀等距地在玻片上进行点样布阵,制作成高密度的DNA芯片。这个过程类似于农民在稻田里插秧,行列有序,然后通过与双色荧光标记的探针分子杂交,使生物分子的反应结果可视化,类似于夏天晚上看到的萤火虫。最后用激光共聚焦扫描仪检测芯片上生物分子产生的荧光信号,从而获得对生物信息的了解,就像大家通过望远镜看遥远的星星一样。

其二是高密度原位合成寡核苷酸的放大。富朵研究小组通过采用半导体制作技术的光刻技术,生产高密度的寡核苷酸芯片,在仅20mm2的玻片表面合成、固定达400 000个寡核苷酸探针,这种技术的基本过程就像通过照相底片印制相片一样,快捷、方便。 

基因芯片(gene chip)通常指DNA芯片,其基本原理是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基因芯片技术在分子生物学研究领域、医学临床检验领域、生物制药领域和环境医学领域显示出了强大的生命力,其中关键就是基因芯片具有微型化、集约化和标准化的特点,从而有可能实现“将整个实验室缩微到一片芯片上”的愿望。基因芯片技术的主要步骤为:芯片制备、样品制备、杂交反应、信号扫描及结果分析。根据基因芯片技术的主要步骤,以实现不同功能可分为以下几类仪器:

1．芯片制备

(1) 微阵列点样制备:芯片点样设备采用了精密机器人运动控制技术,在计算机控制下,系统 X(W)轴、Y 轴、Z 轴承载载玻板/载孔板或点样针架(或喷头)进行组合往复运动,从而实现空间三维运动以完成点样(或喷样)功能,并同时满足微阵列制备过程所需要的高精度和高速度要求。如SmartArrayerTM系列微阵列芯片点样仪。

(2) 原位合成法:原位合成方法是通过采用半导体制作技术的光刻技术,生产高密度的寡核苷酸芯片。

2．样品制备

(1) 核酸提取及纯化:核酸提取及纯化采用精密机器人运动控制技术、精密移液技术、磁珠技术、吸附技术,实现样品和试剂的自动添加、磁珠分离、真空抽滤、加热振荡等功能,全自动完成核酸的提取及纯 化。如LabKeeperTM全自动核酸提取纯化仪。

(2) 核酸质量检测:分光光度法是在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度,对该物质进行定性或定量分析。分光光度计已经成为现代分子生物学实验室的常规仪器。常用于核酸、蛋白浓度和纯度的定量。目前出现新型的微型分光光度计,比如:NanoQ光度计,其利用液滴自身张力,把液滴噙在两个平行面之间的缝隙中,其中一个平面作为反射面,仪器将这个缝隙的距离2倍作为光程,利用光电比色原理,实现对较高浓度的样本测量而不用稀释。

3．杂交反应 该反应是指标记的样品与芯片上的靶基因进行杂交,产生检查信号的过程。在此过程中,一般又包括芯片杂交、芯片清洗设备。根据实验的需求,可以将分子杂交仪分为六大类:①用于大容量的分子杂交仪；②用于Southern或者Northern技术点杂交的杂交仪；③用于小容量的核酸杂交仪；④微孔板原位杂交仪；⑤载玻片原位杂交和平板杂交仪；⑥Western杂交仪。

原位分子杂交、斑点分子杂交,所用的分子杂交箱是振荡式的摇床分子杂交箱；Southern、Northern、Western杂交,所用的杂交仪是旋子式杂交仪,仪器采用独特的滚动式反应架装置,配套特制密封杂交管在水平轴上旋转,使杂交管内壁上的杂交反应膜各处都能均匀地与杂交液反复接触,充分反应。

近年来随着基因芯片技术的飞速发展及应用,出现了自动杂交仪,按自动化程度可将分子杂交仪分为三大类:

(1) 普通分子杂交仪:普通杂交仪一般为封闭式恒温箱式结构,另加上振荡或旋转式可动机构,控制系统实现温度控制、转速等实验参数的调整。

(2) 半自动分子杂交仪:半自动分子杂交仪不仅能完成杂交过程中各条件的控制,还能在人工干预下进行杂交后的其他实验步骤,如孵育、显色等。

(3) 全自动分子杂交仪:全自动分子杂交仪目前主要应用于基因芯片产品,可以实现整个杂交过程的自动化,杂交过程中无需人工参与。基因组DNA与芯片上特异的DNA探针在特定温度条件下进行反应,经过杂交、洗膜、孵育、显色等步骤就可得到检测结果, 这一过程由全自动分子杂交仪完成。

4．信号扫描及结果分析 芯片经杂交反应后,各个反应点形成强弱不同的光信号图像,用芯片扫描仪和相关判读软件进行分析,即可获得有关的生物信息。按成像方式分为激光共聚焦芯片扫描仪、CCD芯片扫描仪；国内较为成熟的为LuxScanTM激光共聚焦芯片扫描仪系列。

5．芯片工作站 芯片工作站实现将微阵列芯片杂交、洗干、成像、判读这几个流程集成在一台仪器中自动化完成。基于微流控动态杂交原理,缩短了反应时间；基于CCD成像技术,可以实时监控芯片杂交、清洗等流程,并对信号成像、判读,根据信号变化情况,优化芯片处理条件,简化了试验优化方法。国内较为领先的为EasyArrayTM3A生物芯片反应阅读仪。  

相关国内外质量标准见表19-1。

表 19-1 微阵列芯片扫描仪国内外质量标准

基因芯片属于分子诊断技术的一大类,是微阵列芯片中较成熟、应用也较广泛的一类芯片,随着分子诊断技术逐渐被临床接受,基因芯片也应用到临床诊断的许多领域。由于目前基因芯片涉及面广,且发展迅速,此处仅列举其中几个方面的应用,以点带面介绍基因芯片技术在临床上的应用情况。

1．基因芯片技术在遗传性疾病诊断上的应用 基因芯片可以在不完全获得基因序列的情况下,直接针对某些突变位点,包括SNP和小片段插入/缺失等进行检测。基于这种特性,可以根据相同表征,将与同一类遗传缺陷相关的基因突变进行组合检测。将携带有不同突变序列信息的探针制作在同一张芯片上,通过从受试者血液中提取的基因组DNA进行检测。无论突变位于基因组任何位置,均可在一次芯片检测中得到结果,配套相应的软件分析,还可以对遗传性疾病的严重程度进行区分。

由于只针对已知的位点进行组合检测,所需探针数量有限,大大降低了芯片制作的成本,以及操作的复杂程度,在具备一般分子检测条件的实验,经过培训的人员均可掌握,结合相应的分析软件,可自动判读结果,无需人工进行数据处理,减少了主观误差。 

遗传性耳聋基因检测试剂盒是基因芯片应用于遗传性疾病检测方面比较典型的产品。根据现已发现并经全国聋病流行病学调查确证的遗传性耳聋基因突变热点信息,采用多重等位基因特异性PCR结合通用芯片(Tag array)的技术对中国人群中常见的遗传性耳聋基因突变热点进行检测。目前已在全国多省市开展了遗传性耳聋筛查项目,对优生优育工作起到了重要作用。 

2．基因芯片技术在感染性疾病上的应用 基因芯片应用于感染性疾病的检测,主要分为两类:一类是进行病原体核酸检测并鉴定种属；另一类是对病原体的药物敏感性进行检测。感染性病原体检测及鉴定芯片就是根据待检测病原体的特征基因序列设计寡核苷酸探针,固定在基质上制成芯片,从来源于患者的样品(痰、鼻咽拭子、血液、粪便等)中提取病原体核酸,经扩增和荧光标记后和芯片杂交检测。基因芯片可以在很短时间(数小时之内)用少量样品获得大量信息,包括样品中病原体种类、亚型等信息；病原体药物敏感性检测芯片是根据病原微生物的耐药性相关基因序列设计寡核苷酸探针,制作芯片进行检测,可以检测耐药性相关位点的突变情况,根据软件分析,综合判断病原体的药物敏感性,帮助医生快速了解患者病原体情况,确定最佳治疗方案。

感染性病原体检测芯片的优点如下:

(1)和传统方法相比,省去了病原体培养的过程。对于某些病原体的检测和分型(包括亚种/株系),基于基因芯片的分子鉴定和分型分析更省时、省力,而且更准确。例如引起肺结核的分枝杆菌,其生长缓慢,需要培养几周才能得到供生化分析、鉴定和分型的纯净培养物。因此传统的基于培养和生化分析的检测费时费力,影响医生给予患者最合适的治疗。病毒的体外培养更困难,因此更适合采用基因芯片等分子诊断技术进行检测。

(2) 基因芯片一次可检测多种病原体,实现病原快速筛查,有助于快速确定病因；针对每种病原体都可设计多条探针实现多重检测,克服了因病原体突变等因素导致的探针失效造成的检测失败问题。和其他单指标检测或低通量检测技术(例如荧光定量PCR)相比,病原体检测基因芯片能有效降低检测的假阴性。

(3) 基因芯片探针设计更灵活,探针长度可以从20mer到70mer。其中短探针敏感性高,适用于检测突变；长探针对突变耐受性好,适用于易突变的病毒检测或序列保守性差的病原体检测。

(4) 扩展性好。芯片中可以增加新探针,满足新病原体、新亚型、新突变株的检测需求。

分枝杆菌菌种鉴定试剂盒采用DNA微阵列芯片技术,通过对痰液和分离株等常见临床样本中的分枝杆菌核酸进行检测,快速获取临床常见致病分枝杆菌的准确种属信息,主要用于结核病和非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)病的辅助诊断,也可用于流行病学调查等领域。与此试剂盒一个系列的产品还有晶芯结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒,通过对两种主要一线抗结核药物——利福平和异烟肼的3个耐药相关基因rpoB、katG及inhA启动子的突变情况进行检测,可以快速对临床致病结核菌株的耐药情况进行准确评估,从而为临床制定、实施有针对性的个体化治疗方案提供重要诊断依据和用药指导。

3．基因芯片技术在肿瘤预警、诊断等方面的应用 肿瘤是目前导致人类死亡的主要原因之一,肿瘤的成因包括外在因素和内在因素。外在因素主要指饮食结构、生活习惯、职业暴露、环境污染等,而内在因素主要指遗传易感性。目前肿瘤治疗最主要的手段仍然是手术,但是肿瘤早期不易发现,常常发现时已是中晚期,手术治疗的效果也是有限的。所以到目前为止,人类征服肿瘤最好的途径是预防和早期发现。

肿瘤的成因分为外因和内因,外因是我们能够改变的,而内因即遗传易感性是我们可以探知的,针对内因、改变外因是预防肿瘤的有效手段。随着基因组学的发展,越来越多与疾病相关的基因被发现,使检测肿瘤的遗传易感性成为可能。爱身谱个体遗传检测芯片是目前唯一针对中国人群开发的用于疾病风险预测和评估服务的生物芯片,通过对血液中提取的遗传物质进行检测、分析和结果统计,对人体常见的9大类68种疾病进行风险评估,其中包括18种肿瘤,此产品正在不断更新疾病种类。爱身谱个体遗传检测的结果能够提示存在肿瘤风险的可能性,当提示有中高风险时,表示根据遗传特征直接导致患该种肿瘤的几率比正常人要高,具有较高发病的潜在可能性,可有针对性地从患病的外因着手,改变生活习惯,定期进行有针对性的体检,以便早期诊断,早期治疗。

肿瘤的治疗以手术为主,早期手术的存活率要远远高于中晚期,早诊是肿瘤治疗的重要因素。各层面的肿瘤标志物已是肿瘤诊断领域研究的热点,蛋白类肿瘤标志物已广泛应用于临床检测,而早于蛋白水平变化的RNA水平变化对于肿瘤早诊具有更重要的价值,尤其是具有调节功能的RNA,常常可以作为疾病检测的标志物,例如miRNA和lncRNA等。lncRNA与疾病的关系也很密切,可以作为疾病分子标志物,已报道的研究主要集中在肿瘤、神经退行性疾病等方面。在肿瘤细胞中,一些lncRNA的表达水平会发生显著改变,如前列腺癌中的lncRNA、DD3。这种表达水平的变化能够作为癌症诊断的标志物和潜在的药物靶点。

4．基因芯片技术在个体化诊疗方面的应用 个体化诊疗是指在充分考虑每个病人的遗传因素(即药物代谢基因类型)、其他生理病理特征及正在服用的其他药物等综合情况的基础上制定安全、合理、有效、经济的治疗方案,是现代医学的重大进展。目前多数药物仍采用标准体重给药法,部分需要检测血药浓度。药代动力学的个体差异很大,特别是由于遗传性造成药物代谢速率明显差异的情况。随着人类基因组学的发展,药物基因组学为个体化诊疗提供了新的理论依据。

要进行个体化诊疗,首先要了解与某种疾病相关的药物代谢基因类型,根据药物代谢快慢调整药物用量。根据患者的基因结构,特别是发生变异的基因结构,有针对性地选择药物和给予适合患者的剂量,被称为“基因导向性用药模式”。目前已有医院在临床上针对三环类抗抑郁药、华法林及硫唑嘌呤等遗传变异型反应开展药物治疗基因型诊断。

随着药物基因组学的发展,同检测遗传性疾病的原理类似,基因芯片技术可以针对治疗同一类疾病的多种药物代谢相关基因同时进行检测,可以快速、综合地提供患者对各种不同药物的代谢情况信息,供医生制定相应的治疗方案。目前国内厂家在研的抗拴个体化用药指导基因芯片主要针对华法林和氯吡格雷这两种药效与患者基因型密切相关的药物,可辅助医生有效指导药物的用量,减少药效不足或患者严重出血的发生率。

虽然基因芯片技术应用于临床具有很多优势,但仍然存在一些急需解决的问题,包括:基因芯片操作各个环节(包括核酸扩增、标记、芯片杂交和扫描检测)还未完美地整合在一起,实现集成化和自动化操作,造成基因芯片操作相对复杂,需要人工操作的步骤较多,有可能产生交叉污染,这成为基因芯片技术走向临床应用的一个障碍；基因芯片检测的成本仍然相对较高,因其需要进行高精度荧光检测,因此配套仪器相对复杂、昂贵。

近来随着国内基因芯片相关仪器设备的开发成功,已经显著降低了仪器成本,有力地推动了基因芯片的应用。并且,一些基于基因芯片的试剂盒产品也成功实现国产化,降低了基因芯片检测费用。

微阵列芯片扫描仪仪器管理要求与程序：

1．仪器安装

(1) 微阵列芯片扫描仪可由用户进行安装,由于扫描仪为精密光学仪器,请在安装前认真阅读用户手册,确保空间、电磁兼容性、温湿度等环境满足要求。

(2) 检查无误,安装并接通电源。

(3) 开机预热。

(4) 首次使用需进行校验。

(5) 正常运行方可用于生物试验。

2．维护保养

(1) 日常维护

1) 关机。

2) 用洁净软布擦拭仪器表面。

(2) 季度维护:用户参照用户手册进行校验维护。

(3) 厂家维护

1) 当扫描仪更换使用环境或长时间(半年及以上)未使用后重新启用时,为了保证系统性能,请在授权客服人员的帮助下进行系统校准。

2) 当扫描仪不能正常工作时,请联系厂家进行维修及维护。

3．校验方法

(1) 使用随机配备的校准芯片。

(2) 基本项测试,包括运动控制测试、激光性能测试和电路性能测试,一般用于诊断仪器硬件故障。

(3) 焦距校准,温湿度的变化及长时间使用造成的机械磨损等原因都会引起微阵列芯片扫描仪焦距位置的变化,因此需要定期对焦距位置进行调整。

(4) 信号校准,是将微阵列芯片扫描仪调整到出厂时的信号水平,可以在一定程度上解决因激光光强减弱、光路元件老化等原因引起的信号变化。当信号校准无法调整到出厂信号水平时,请联系授权客服人员更换系统元器件。

(5) 系统性能测试,包括重复性测试和一致性测试。

(6) 上述校验在操作时,系统可一键操作实现。通过校验,确保试验数据的准确性、可靠性。