干式化学技术

       1930年pH试纸条的出现，是最早应用于临床的干式化学技术，开创了试纸条法干式化学技术的先河。1956年尿糖试纸条及1972年尿试纸条生化分析仪的出现，扩大了试纸条干式生化临床应用的范围。最初开发的干式化学试纸条，采用最简单的二层结构。在当代临床检验的干式化学技术中，最具代表性的是多层膜法，即干化学的多层膜试剂载体。它在其不断发展的新技术基础上出现，集现代化学技术、光学技术、酶学技术、化学计量学及计算机技术于一体，作为定量方法已达到常规化学测定的水平，某些项目的测定甚至可以与参考方法相提并论。

干式化学技术也称作干试剂化学技术或固相化学技术，反应的基本原理是将测定中所需的多种反应试剂固化在试剂载体中，测定时将液体样品（血清、血浆、尿液等）直接加到载体上，以样品中的水分为溶剂，引起待测物与载体中的试剂发生化学反应并产生光信号，最后通过肉眼定性或用仪器定量检测光信号变化。

1、简单显色技术

采用最简单的二层结构（图1）。在支持层塑料基片上有一试剂层纤维素片，在纤维素试剂层中预固定全部反应试剂，在样本加入后直接与其发生反应，通过反射光度计测定其颜色的改变，从而计算待测成分的浓度。这种简单的二层结构制作工艺简单且较为粗糙，不能有效地排除其他成分的干扰，因而只能用于定性分析或半定量测定，这就限制了它在准确定量方面的应用。

图1  干化学二层膜结构

2、多层涂膜技术

在二层结构的基础上加一多孔胶膜过滤层即组成三层结构（图2），最常见的是微量法测定葡糖糖的试剂条。

图2  干化学三层膜结构

三层试剂载体的测定光路是通过透明的塑料基片，而不经过最上面的过滤层，其中，过滤层能够有效地过滤样品中的杂质干扰物，并且对试剂层起保护作用，保证了待测成分测定的稳定性和准确性。

利用多涂层薄膜干片技术，将所需要试剂预固相在多层薄膜和透明支持基垫上，当血浆、血清、尿液或是脑脊液与这些已含有化学物质的干式薄膜接触时发生反应并对反应信号进行测量。根据测定方法的不同可将多层膜分为三种类型：比色/速率法干片、离子法干片和免疫速率法干片。

（1）比色/速率法干片：比色/速率法干片主要用于常规生化项目的检测，其模式图如图3所示。所有检测项目的试剂都做成干片，成为干片试剂，干片试剂的结构从上到下一般分为扩散层、试剂层和支持层（图3），其同三层膜结构的区别在于试剂层，该层层数视所检测的物质和所采用的方法而定，通过测定干片的颜色变化来确定化合物的浓度。

图3  比色/速率法干片模式图

①扩散层：扩散层是位于干片的最上层，一般是由高密度的TiO2、BaSO4和醋酸纤维素等组成的直径100～300μm的多孔聚合物，且其孔径在15～30μm，呈毛细网状结构，中空体积占60%～90%。当待测样品定量加到干片试剂时，扩散层这种结构可以将样品快速、均匀地分布到下层，毛细作用将样品迅速吸入多孔扩散层，同时又被先生成水合物的凝胶层所排斥。扩散层不仅可以阻留细胞、结晶和其他小颗粒，也可以根据实际需要让大分子，如蛋白质、脂肪等滞留，从而达到消除溶液中影响检测反应的干扰物质。同时，在扩散层中TiO2和BaSO4 等反射系数达95%以上物质的存在，可以有效地隔离扩散层中的有色干扰物，使反射光度不受其影响，同时这些具有高反射系数的反光物质也为检测提供了反射背景，使入射光最大限度地反射回去，以减少因光吸收引起的测定误差。在一些特定的干片试剂中，扩散层还含有选择性阻留某种成分或启动某种反应的物质，以提高分析的特异性。

②试剂层：在化学试剂层中，根据实际测定的需要，可由数层至数十层组成。试剂层的结构能够控制多步化学反应的反应次序，分为辅助试剂层、试剂层、显色层等。辅助试剂层在试剂层的最上层，当样品通过扩散层后，辅助试剂层可进一步减少样品中的干扰物质。辅助试剂层主要是用来去除血清内源性干扰物，最常见的是在辅助层固化维生素C酶，以消除血清中维生素C对H2O2的还原作用；同时，该层还可以运用免疫沉淀、凝胶和亲和过滤及渗析等方法，选择性地把待测物和干扰物分离，从而使测定结果更加准确。如测胰淀粉的干片试剂，在辅助试剂层中就含有抗唾液淀粉酶的单克隆抗体，使样品中的唾液淀粉酶阻留在辅助层中，而只有胰淀粉酶向下转运，从而产生显色反应。辅助试剂层在多层膜试剂载体中是一个非常重要的结构，也是多层膜试剂载体测定结果准确、误差小的一个重要保证。试剂层中按照反应的顺序涂布了不同的化学试剂，包含检测反应所需的各种酶、缓冲液和催化试剂等，使反应按照预先设定的次序依次进行反应。使待测物通过反应区时，可以利用物理、化学或生物酶学等反应转化为相应的与显色剂结合的化合物，实现对待测物的准确检测，其主要原因是针对不同检测项目实行个性化设计为不同的化学反应提供了最理想的物理和化学反应环境。显色层中包含染料或相似的指示剂，试剂层产物与其结合，形成有色复合物，其颜色变化与分析物浓度成正比，被反射光检测。

③支持层：此层是光学透明的塑料基片，起到支持的作用，同时允许入射光和反射光完全透过，以便对有色复合物进行检测。因为是多层的设计，往往在实际检测中，常需对上述的基本结构加以改进，以满足临床需要。如酶活性的测定，需将酶的底物放在扩散层上，即在扩散层上进行酶促反应，其产生的底物小分子再渗透到下面的试剂层显色，从而保证显色的快速均一。而对于没有底物生成的大分子物质如白蛋白测定，可将试剂层上移来完成反应，而不是常用的下移至试

剂层反应。总之，多涂层薄膜干片，革除了液体试剂，为适应不同反应而改进的结构，使测定更加准确、快速和简便。

（2）离子法干片：钠、钾、氯等无机离子的检测，是干化学检测项目中的传统项目，多采用离子法干片，即直接选择性电极离子检测干片，其主要利用离子选择法电极技术，样本无需稀释，实现对不同离子的检测。离子干片是由盐桥将两个离子选择性电极相连，通过电位计来测量患者样品和已知参比液之间的电势差，从而计算出钠、钾、氯等无机离子的浓度。检测如图4所示。

图4  离子干片模式图

（3）免疫速率法干片：如图5所示药物浓度和蛋白质等检测主要采用免疫速率法干片，一般分为竞争性和非竞争性两类干片，通常在检测中需要液体反应底物：①竞争性干片：可用于地高辛、苯妥英和苯巴比妥等的检测，采用多点速率法检测分析物浓度。靶分析物和酶标抗原竞争有限量的抗体结合位点，然后加入含底物的免疫洗液，一方面洗去未结合物质，另一方面抗原抗体复合物与底物反应显色。加入免疫洗液后孵育2.5min，并在670nm波长处进行读数，通过速率的变化来计算靶分析物浓度。②非竞争性干片：读数时采用定点速率法。靶分析物与固相抗体、酶标抗体形成“三明治”夹心结构，加入含底物的免疫洗液，洗去未结合物质，同时与抗原抗体复合物反应显色，孵育2.5min在670nm处读数，发射光密度与靶分析物浓度成正比。

图5  免疫速率法干片模式图