细胞因子测定

1、免疫细胞之间的信息传递可以通过细胞表面的受体与配体的相互作用，也可以通过细胞产生的可溶性分子。这些可溶性细胞因子可以由多种细胞产生，通常单核细胞、淋巴细胞、内皮细胞及成纤维细胞等都可以产生，统称为细胞因子(cytokine，CK)，能影响这些细胞和其他细胞的行为和特征。细胞因子是除激素和神经递质外，人类细胞之间传递信息的重要信使。

2、细胞因子定义及生物学特征：细胞因子(CK)是由机体的免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌的具有生物学活性的小分子可溶性蛋白。细胞因子多为糖蛋白，分子量在10～25 kDa；一般以单体形式存在，少数以二聚体、三聚体或四聚体的形式发挥生物学功能。细胞因子主要调节机体的免疫应答、造血功能和炎症反应等，其虽然种类很多，归纳起来主要有如下共同特征：

(1)通常以自分泌或旁分泌的形式作用于自身及附近细胞，在局部以高浓度短暂地发挥作用。在某些炎症情况下，也可以内分泌的形式作用于远处靶器官，引发全身效应。

(2)与细胞膜表面的特异性受体高亲和力结合后，通过受体介导的信号转导高效能的行使调节和效应功能。他们相互作用使细胞内级联信号激活，最终导致转录因子的激活。这些转录因子与相应DNA片段结合而影响许多基因的活性。

(3)一种细胞因子可以由多种不同细胞在不同的条件下产生；而一种细胞也可以产生多种细胞因子；一种细胞因子可以对多种类型细胞发挥多效作用；多种不同的细胞因子也可以发挥相似或重叠的作用。

(4)细胞因子以网络形式发挥相互作用。一种细胞因子可以诱导或抑制另一种细胞因子的产生和功能发挥；不同细胞因子可以显示相同的活性，调节同一细胞因子受体的表达；不同细胞因子发挥作用可以互相协同，对同一目标产生相同的效应；不同的细胞因子的作用相互拮抗，可对同一目标产生相反的效应。

3、细胞因子能促进和调节天然免疫(IL-l、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-a， IFN-a， IFN-β等抗病毒因子、炎性因子和调节因子)；参与适应性免疫(lL-2，IL-4、IL-5，IFN-y、TGF、IL-10)和造血细胞的生长分化（IL-3、IL-6、IL-7、IL-9、IL11、GM-CSF、G-CSF)。

4、细胞因子分类(Th1、Th2细胞来源)：细胞因子可以分为白细胞介素、集落刺激因子、干扰素、肿瘤坏死因子、转化生长因子、趋化因子及其他细胞因子(如表皮生长因子、血小板衍生生长因子等)。

5、作为细胞间的信使分子，细胞因子的功能是通过与靶分子上的受体结合，产生特定的生物学效应。T细胞在免疫应答中起关键作用，其分泌的细胞因子与细胞免疫、体液免疫和免疫抑制及炎症反应相关。

6、随着对Th细胞分化及调节功能研究的深入，Th1、Th2、Th3的概念提出后，对细胞因子进行了重新分类，下面介绍Th1/Th2细胞因子的主要功能。

(1)Th1型细胞主要产生的细胞因子：Th1细胞是一类辅助性CD4+T细胞，主要分泌IFN-y，IL-2，此外还包括IL-12、IL-18、GM-CSF等。Th1 型细胞因子与CTL细胞的增殖、分化和成熟有关，促进细胞介导的免疫应答。

IFN-γ：由激活的CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞产生。这些细胞经抗原刺激后直接启动该基因转录激活。其免疫调节作用主要有：激活单核/巨噬细胞，诱导和增强MHC分子的表达、促进T细胞分化(Th0向Th1分化)、促进IgG2a和IgG3类别转换而抑制IgG1和IgE类别转换、并能激活中性粒细胞和上调NK细胞杀伤作用。

IL-2：主要由CD4+T细胞产生，CD8+ T细胞产生少量IL-2。也称T细胞生长因子，主要生物学功能是促进T细胞增殖(由G1期至S期)和细胞因子生戚，增强NK细胞活性和增强介导的细胞凋亡。既是自分泌生长因子也是旁分泌生长因子，IL-2与T淋巴细胞受体结合后驱动T细胞发挥细胞免疫应答。IL-2是T细胞活化经进入细胞分裂的关键成分，而T细胞活化直接影响整个特异性免疫应答的发生。

IL-12：其激活形式是由p35和p40两个亚单位形成的异二聚体。其作用的靶细胞主要是T细胞和NK细胞：刺激T细胞和NK细胞分泌IFN-γ，促进CD4+T细胞向Th1细胞分化，有利于提高Mφ细胞活性，增强NK细胞和CD8+T细胞杀伤功能。是连接天然免疫和获得性免疫的一个重要纽带，能有效提高机体的细胞免疫防御功能。

(2)Th2型细胞主要产生的细胞因子：Th2型细胞能分泌IL-4、IL-5等细胞因子，与B细胞增殖、分化、成熟有关，能促进抗体生成，增强抗体介导的体液免疫应答。还分泌IL-10、IL-13以及CCL-7等一些趋化因子。

IL-4：主要由Th2细胞产生，激活的肥大细胞、嗜碱粒细胞也能产生，此外一部分γδT细胞也可以大量分泌IL-4。其生理功能是调节IgE和肥大细胞或嗜酸粒细胞介导的免疫应答。其功能也包括诱导Th2细胞生长和分化，诱导B细胞发生抗体类别转换产生IgE，但抑制向IgG2a和IgG3的类别转换，以及刺激内皮细胞分泌趋化因子和黏附分子等。IL-4是肥大细胞生长因子，与IL-13协同作用刺激肥大细胞增殖。

IL-5：主要由Th2细胞和激活的肥大细胞产生。功能是刺激嗜酸粒细胞生长和分化，激活成熟嗜酸粒细胞，增强其杀伤寄生虫的能力。与IL-4作用互补，共同促进Th2细胞介导的过敏反应，协同刺激B细胞生长和分化，并能增强成熟B细胞合成IgA的能力。

IL-10：一种公认的介导免疫抑制的细胞因子，一般将其归为免疫调节细胞因子。以同源二聚体形式发挥作用，可抑制Th1细胞应答及其细胞因子合成，选择性抑制单核-巨噬细胞的某些功能，抑制Mφ的抗原提呈功能及其细胞因子合成，促进B细胞增殖分化和抗体产生。

7、细胞因子测定的临床应用

细胞因子测定的临床应用主要有：特定疾病的辅助诊断、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后、细胞因子临床治疗应用的监测、病理变化和损伤机制研究。

1）细胞因子测定的临床应用原则：细胞因子的一个最大特点就是功能的多样性和组织细胞的非特异性，这也就决定了其测定的临床应用必须考虑细胞因子的来源以及测定方法的应用。

(1)要全面了解一种细胞因子在特定疾病中的意义，应使用多种方法综合分析。由于细胞因子在体内的含量甚微，给细胞因子的检测带来困难，同时由于细胞因子种类繁多，生物学效应表现为多效性、重叠性、拮抗效应和协同效应，形成十分复杂的细胞因子网络。因此，在检测细胞因子时，常采用多种方法综合分析。

(2)测定标本的适当选择。正常的生理情况下，血液循环和体液中各种细胞因子的浓度极低，只有在特定的病理状态下，如炎症、肿瘤等，某些细胞因子才能出现大量分泌，此时可用血液或体液标本直接检测。如想了解局部炎症下细胞因子的分泌情况，则应以局部分泌液作为检测标本。要对细胞因子进行细胞内定位或检测细胞因子的基因，可以相应的细胞作为标本。

(3)同时测定多种细胞因子，为了解T细胞、巨噬细胞和上皮样细胞分泌相应细胞因子的功能，应同时测定多种细胞因子。

2）作为特定疾病诊断的辅助指标正常情况下，细胞因子表达和分泌受机体严格的调控，在病理状态下，细胞因子会出现异常性表达，表现为细胞因子及其受体的缺陷，细胞因子表达过高等。在特定的疾病情况下，某种细胞因子的定性和(或)定量测定可作为疾病诊断和鉴别诊断的辅助指标。如慢性乙肝和慢性丙肝患者外周血单核细胞用LPS刺激后，其IL-1和IL-2分泌能力低于正常人， 其他非病毒性肝病如酒精性肝硬化和原发性胆汁性肝硬化患者则无变化。

在炎症、自身免疫病、变态反应、休克等疾病时，某些细胞因子的表达量可成百上千倍地增加，例如为风湿性关节炎的滑膜液中可发现IL-l、IL-6、IL-8水平明显高于正常人，而这些细胞因子均可促进炎症过程，使病情加重。应用细胞因子的抑制剂有可能治疗这类炎症性细胞因子水平升高的疾病。

3）评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后

细胞因子的产生分泌与机体的免疫状态密切相关。HIV感染患者发病前，机体免疫功能尚处于正常。监测如TNF-α等细胞因子的水平，有助于了解机体的免疫功能状态、预测病情发展。

细胞因子的继发性缺陷往往发生在感染、肿瘤等疾病以后，如人类免疫缺陷病毒(HIV)感染并破坏Th后，可导致Th细胞产生的各种细胞因子缺陷，免疫功能全面下降，从而表现出获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的一系列症状。

4）细胞因子临床治疗应用时的监测：在进行特定疾病的治疗时，可采用补加细胞因子和阻断细胞因子作用两种方法进行特定疾病的治疗，治疗时进行相应细胞因子的胞内和(或)胞外测定，对于治疗效果的监测及指导用药具有重要意义。目前，细胞因子已广泛应用于临床的已有EPO、IFN-α、G-CSF、GM-CSF以及白细胞介素等。 为了研究细胞因子在生理系统的作用以及了解细胞因子产品用于临床治疗的效果，进行细胞因子的检测就必不可少。

综上所述，应认识到在检测细胞因子时，必须考虑到细胞因子的作用具有网络性的特点和上述问题。人们需明确检测方法所测定的细胞因子成分，并考虑其抑制剂和可溶性受体的水平，将生物分析法和免疫分析法结合使用，有可能得到较为可靠的结果。当然，准确、灵敏的检测方法是进行细胞因子研究的首要条件，临床诊断需要相对容易的操作。随着细胞因子在治疗中应用的逐步增加，其检测必将被广泛地使用。

1、生物活性检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法各有优缺点，可互相弥补，在实际应用中，应根据各自的实验目的和实验室条件进行选择。

2、生物学测定法是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株(即靶细胞)的促进增殖作用，以增殖细胞中的DNA合成或酶活性为指标，间接推算出细胞因子的活性单位，一般以U/ml表示。生物学检测法比较敏感，其优点是只有具有生物活性的细胞因子才能被检测，是最可靠的方法。然而由于该方法本身的要求(需要长期培养依赖性细胞株)和细胞因子效应的冗余性，严重限制了生物测定方法的特异性，所以生物学方法目前已经几乎完全被酶免疫测定取代。免疫学检测法是将细胞因子作为抗原进行定量检测。

3、免疫学检测法其优点是操作简便、迅速，重复性好，高特异性、高灵敏度、易标准化，缺点是所测定的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，因此要了解细胞因子的生物学效应，必须结合生物学检测法。

4、分子生物学检测法是对细胞因子的DNA及mRNA直接检测，反映细胞因子的基因有无缺失、 扩增或对某些细胞因子的多态性进行分析。分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供有关细胞因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。

5、由于细胞因子的多效性和作用的复杂网络，没有任何疾病可以将细胞因子作为疾病特异性标志。细胞因子的体内检测不适合以鉴定诊断为目的，只适于对一些过程活动程度的检测，比如一些不应出现的免疫反应如移植排斥反应、自身免疫性疾病或与感染相关的发病机制。

目前细胞因子的主要检测方法包括三大类：①生物活性检测法；②免疫学检测法；③分子生物学检测法。