淋巴细胞亚群检测 （Lymphocyte subgroup detection）

总的CD3^＋ T淋巴细胞百分数：总T淋巴细胞百分比58-86%；总T淋巴细胞绝对值：1000-2470个/μl

辅助性/诱导性T细胞Th (CD3⁺CD4⁺CD8^-)：百分比32.8-52. 8%；绝对值：570-1330个/μl

细胞毒/抑制性T细胞Tc (CD3⁺CD4^-CD8⁺)：百分比19.7-38.9%；绝对值：330-910个/μl

双阳性T细胞(CD3⁺CD4⁺CD8⁺)：百分比0-2%；绝对值：0-80个/μl

外周血双阴性T细胞(CD3⁺CD4^-CD8^-)：百分比2.1-6.7%；绝对值：42-153个/μl

NKT 细胞（非HLA依赖细胞毒T细胞CD3⁺CD56⁺）：百分比0.6-8.7%；绝对值：32-158个/μl

B淋巴细胞（CD3^-CD19⁺）及其亚群：B淋巴细胞百分比5-20%；B淋巴细胞绝对值：130-390个/μl

自然杀伤细胞（ naturalkillercell，NK）：自然杀伤细胞百分比5-20%；自然杀伤细胞绝对值：150-620个/μl

在流式细胞术中，测定某细胞群体或者亚群的比例是最简单、最基本的应用，对血液病、肿瘤、免疫性疾病如自身免疫病、免疫缺陷病的诊治，器官移植排斥反应的监测和免疫系统功能如淋巴细胞活化研究等有重要价值。细胞在各自正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中，其细胞膜表面均可表达可供鉴别的特殊结构，即表面标志。利用荧光素标记的单克隆抗体作为分子探针，可对这些细胞表面标志进行流式细胞术的检测，进而对细胞 的种类、亚型以及功能特征进行分析。

（一）T淋巴细胞及其亚群检测

T细胞是一个相当复杂的不均一体，又不断在体内更新，在同一时间可以存在不同发育阶段或功能的亚群。在T淋巴细胞分类中，T细胞根据表面标志和分化抗原的不同分为αβT细胞（约占95%）和 γδT细胞（约占5%），其中αβT细胞又可分为CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞。 CD4⁺T细胞根据其分泌的细胞因子和介导的功能不同再分为Th1和Th2细胞；CD8⁺T细胞主要为细胞毒性T细胞。CD4⁺T在维持机体的细胞免疫和体液免疫中具有枢纽作用，是HIV感染的主要靶细胞，而其本身又是免疫反应的中心细胞。

辅助 T 淋巴细胞（Th），可以辅助 B 淋巴细胞产生抗体；抑制性T细胞（Ts），有抑制B细胞及其他免疫细胞的功能；效应性T细胞（TE），有释放细胞因子的功能；细胞毒性 T 淋巴细胞（Tc），执行细胞免疫，是排斥同种异体移植物、杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞的效应细胞。

淋巴细胞亚群的测定主要用于了解恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷、重症病毒感染、自身免疫病等患者机体的免疫功能是否处于平衡状态。某种细胞亚群所占百分比过高或过低，都提示存在免疫功能紊乱，但一般情况下对疾病的诊断和鉴别无特异性。

人体感染HIV后，涉及的主要病理过程就是免疫系统的损害，主要表现为：CD4⁺T细胞进行性减少，同时CD8⁺T细胞数量增加，CD4⁺/CD8⁺比例倒置。CD4⁺T细胞数量的减少和功能的降低是引起人体免疫功能却显得主要原因，因此CD4⁺T细胞计数为直接测定免疫功能的方法，是判断HIV感染患者免疫系统损害状况最明确的指标，同时是判断抗病毒治疗是否有效的重要指标。

1、总的CD3^＋ T淋巴细胞百分数（参考范围：总T淋巴细胞百分比58-86%；总T淋巴细胞绝对值：1000-2470个/μl）：可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病； T 淋巴细胞上升多见于慢性活动性肝炎或慢性迁延性肝炎；器官移植排斥反应；重症肌无力；甲状腺功能亢进与甲状腺炎患者；霍奇金病。T 淋巴细胞下降多见于恶性肿瘤；自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等；原发性免疫缺陷病，如先天性胸腺发育不全等、艾滋病;接受放疗、化疗或者使用肾上腺皮质激素等免疫抑制药。

2、辅助性/诱导性T细胞Th (CD3⁺CD4⁺CD8^-)（参考范围：百分比32.8-52. 8%；绝对值：570-1330个/μl）：主要功能是辅助其他免疫细胞产生免疫应答效应或者调节免疫应答，减少可见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷病、艾滋病、应用免疫抑制剂的患者等。
3、细胞毒/抑制性T细胞Tc (CD3⁺CD4^-CD8⁺)（参考范围：百分比19.7-38.9%；绝对值：330-910个/μl）：主要执行细胞免疫，是排斥同种异体移植物、杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞的效应细胞，增多见于自身免疫性疾病，如SLE、艾滋病初期、慢性活动性肝炎、肿瘤及病毒感染等。

4、Th/Tc：在临床上常用 Th/Tc 比值来评价自身免疫状态。用于器官移植后免疫监测时： CD4/ CD8比值下降提示并发凶险感染，当 ＜0.2时，必须停用免疫抑制药；CD2^＋HLA-DR^＋增加5%-10% ，且不伴有CD25的增加，提示巨细胞病毒感染； CD25高于正常值5%-10%，表明即将或已发生排斥。在同种异体器官移植以后，肾功能稳定的患者可出现 Th淋巴细胞下降， Tc 淋巴细胞上升，而 Th / Tc 比值无明显变化。净化自身骨髓移植后表型重建期间可有 Th 细胞下降， Th / Tc 比值下降。

5、双阳性T细胞(CD3⁺CD4⁺CD8⁺)（参考范围：百分比0-2%；绝对值：0-80个/μl）：在正常人外周血中极少，但是在重症肌无力、原发性免疫性血小板减少症、多发性硬化症等自身免疫性疾病中表达量增高。

6、外周血双阴性T细胞(CD3⁺CD4^-CD8^-)（参考范围：百分比2.1-6.7%；绝对值：42-153个/μl）：具有免疫抑制功能并能诱导耐受，主要是在临床急性炎症性疾病时明显升高，可能参与了急性感染、严重创伤等患者的细胞免疫调节。

7、NKT 细胞（非HLA依赖细胞毒T细胞CD3⁺CD56⁺）（参考范围：百分比0.6-8.7%；绝对值：32-158个/μl）：是 T淋巴细胞中的一个比较特殊的亚群，兼具T细胞和 NK细胞的某些特性，能迅速分泌一些具有免疫调节作用的细胞因子及具潜在的细胞毒效应。

8、其它

初始CD4⁺T细胞在不同的诱导条件下可以分化为不同的T细胞亚群，发挥不用的免疫应答作用。自1986年Mossman和Coffman首次报了Th1和Th2细胞亚群后，人们又先后发现了Th17、Tfh、Th22等细胞亚群。

（1）Th1(CD3⁺CD4⁺IFN-γ⁺IL-4^-)和 Th2(CD3⁺CD4⁺IFN-γ^-IL-4⁺)细胞

辅助性T细胞是T细胞的亚群之一，通常指一类具有协助体液免疫和细胞免疫应答的T细胞亚群。根据所分泌细胞因子的不同，CD4⁺T细胞可分为Th1、Th2等细胞亚群。Th1细胞主要分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α，它们有利于B细胞产生具有调理作用的抗体（IgG、IgA）和与补体相结合的抗体（IgM、IgG），促进巨噬细胞的活化，引起T细胞介导的细胞毒作用和细胞免疫。以Th1为主的免疫应答主要引起依赖于吞噬细胞的炎症。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13，它们主要引起较强的抗体反应（包括IgE），促进嗜酸性粒细胞的分化和活化，产生一种不依赖于 吞噬细胞的炎症。

测定Th1/ Th2细胞的调节对维持机体正常的免疫功能至关重要。Th1/ Th2的失衡与自身免疫病、过敏性疾病、肿瘤、移植排斥反应以及感染性疾病的发生发展密切相关。

（2）CTL细胞(CD2⁺CD3⁺CD4^-CD8⁺)

CTL细胞是具有免疫杀伤效应的功能亚群。CTL细胞的TCR通过识别MHCⅠ类分子限制性抗原，通过分泌穿孔素、颗粒酶和Fas/FasL等途径直接、连续、特异性地杀伤靶细胞。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。

（3）调节性T细胞

调节性T细胞不同与Th1、Th2细胞，而具有免疫抑制功能，参与多种免疫性疾病发生的病理过程。主要包括自然调节性T细胞，诱导性调节性T细胞以及CD8⁺调节性 T细胞等。以自然调节性T细胞（CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺）为例。其主要存在于外周组织中，通过分泌TGF-β和IL-10等免疫抑制性细胞因子阻止潜在的自身免疫反应。因其具有免疫抑制作用，在多种免疫性疾病中起重要的调节 作用。

（4）Th17细胞是在IL-6、IL-23和 TGF-β存在的诱导条件下分化而成，主要产生IL-17A、IL-17F、IL-6和TNF-α。而不产生IFN-γ和 IL-4，因此成为Th17细胞亚群。Th17细胞介导炎症性反应（防御胞外病原菌感染）、自身免疫性疾病、肿瘤和抑制排斥等的发生和发展。IL-17的主要生物学功能是促进炎症反应，与类风湿关节炎、哮喘、多发性硬化症、银屑病和移植排斥反应密切相关。

（5）Tfh细胞分泌IL-21，定位于淋巴滤泡，是主要负责辅助B细胞的Th细胞亚群，在刺激B细胞的增殖、分化以及免疫球蛋白类别的转换中起着十分重要的作用。2000年Schaedi和Breitfeld几乎同时报道了一个定位于淋巴滤泡，具有辅助B细胞功能，表行为CXCR5⁺CD40L⁺ICOS⁺的T细胞亚群，称为滤泡B辅助性T细胞。2002年Moser等提出了Tfh可能是不同于Th1和Th2的一个新的T细胞亚群。直到最近才确认。Tfh是主要负责辅助B细胞的T细胞亚群。

（6）Th22是最近发现的CD4⁺T细胞功能 亚群，表达CCR6、CCR4和CCR10，产生IL-22和IL-13，但是不产IFN-γ、IL-4和Th17的细胞亚群。Th22主要在皮肤的自稳调节和病理状态中发挥重要作用。

（二）B淋巴细胞（CD3^-CD19⁺）及其亚群（参考范围：B淋巴细胞百分比5-20%；B淋巴细胞绝对值：130-390个/μl）

B淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分，主要执行体液免疫功能，在抗原刺激下可分化为浆细胞，合成和分泌免疫球蛋白发挥强大的免疫效应作用。根据CD19和CD5的表达情况，可分为B1细胞（CD5⁺CD19⁺）和B2细胞（CD5^-CD19⁺）。CD5表达于未成熟的B1细胞表面，是B1细胞的重要标志。B1细胞产生抗体有两个特点：一是不发生体细胞突变，无亲和力成熟，多为低亲和力的IgM、IgA和IgG3，参与抗细菌感染的黏膜免疫应答，不产生记忆细胞；二是能产生多种针对自身抗原的抗体，与自身免疫病相关。B2细胞即成熟的B细胞，产生高亲和力抗体，同时表达mIgM和mIgD，，行使体液免疫功能，发挥抗原提呈和免疫调节作用。简言之，B2细胞是成熟的B细胞，B1细胞是B2细胞的前体。

B细胞增高常与B细胞恶性增殖有关，主要见于慢淋、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、艾滋病以及巨球蛋白血症等。B细胞减低主要与体液免疫缺陷有关，常见于性联丙种球蛋白缺乏症、严重联合免疫缺陷病等。

（三）自然杀伤细胞（ naturalkillercell，NK）（参考范围：自然杀伤细胞百分比5-20%；自然杀伤细胞绝对值：150-620个/μl）

NK细胞存在于外周血大颗粒淋巴细胞中，是机体固有免疫系统的重要组成部分，在抗病毒感染免疫、肿瘤免疫、移植排斥反应以及在免疫的调节中起着十分重要的作用。它对靶细胞的细胞毒活性不依赖于抗体，无MHC限制性。它们的数量、细胞毒活性及产生细胞因子的能力是机体免疫系统的重要指标。

长期以来的研究表明，NK细胞并不是一个均一的细胞群体，根据其表型和功能特点可以将NK细胞分为不同的亚群。例如NK细胞在Th1(IL-12⁺抗LL-4)或Th2(L14⁺抗IL-12)细胞培养条件下分化为NK1和NK2亚群，NK1细胞分泌IFN-γ而NK2细胞分泌IL-5和IL13;根据在IL-2诱导下所表现出的黏附特点的不同，可分为黏附NK(A-NK)和非黏附NK(NA-NK)亚群，两个亚群无论表型、细胞因子分泌、增殖能力还是杀伤功能均有差别；根据NK细胞表面CD56分子表达密度的不同，可将NK细胞分为CD56high和CD56low亚群，这两个细胞亚群在免疫应答的过程中发挥着不同的生物学功能：CD56细胞活化后可产生多种细胞因子，具有免疫调节功能但杀伤功能较弱；而CD56^-细胞只产生少量的IFN-γ，主要发挥自然杀伤和ADCC作用。但是在临床和科研工作中，只检测CD56细胞作为NK细胞数量和功能的评价只能代表细胞亚群，因为在正常人周围血单个核细胞中还存在着CD56^-CD16⁺NK细胞。研究发现在HIV感染中，CD56^-CD16⁺NK细胞亚群杀伤功能降低，并伴随抑制性受体的表达增高和杀伤功能受体的表达降低，表明NK细胞的功能缺陷可能与某个特定的亚群相关。有研究，根据NK细胞CD56和CD16分子表达密度的不同将人周围血NK细胞分为CD56highCD16^-、CD56lowCD16^-、CD56⁺CD16⁺和CD56⁺CD16^-四个亚群，分析其表型和杀伤相关分子的表达，发现不同亚群的表面特征和杀伤相关分子的表达不同，并可据此将NK细胞进一步分为多个亚群。NK细胞的不均一性和亚群的复杂多样性可能与NK细胞发育分化的不同阶段有关，或者表明了NK细胞功能上的差别。

NK 细胞增高常见于某些病毒感染性疾病的早期、长期使用干扰素或使用干扰素的诱导物、骨髓移植后、习惯性流产。

NK 细胞降低常见于恶性肿瘤，特别是中晚期或伴有转移的肿瘤；免疫缺陷病及使用肾上腺激素等免疫抑制药；部分病毒感染、细菌感染及真菌感染；某些白血病及白血病前期。

在某些白血病如 NK 细胞白血病细胞80%-90%CD16阳性，95%CD56阳性。

1、检查前禁忌暴饮暴食和剧烈运动，宜平静状态，空腹抽血检查。检查时要求：注意血清标本不被污染，及时送去检测。

2、对荧光素标记抗体用量应做预试验，找到最佳抗体使用浓度。

3、每份样品检测的同时必须设置同型对照，即用荧光素标记的正常小鼠Ig（Ig亚类与荧光抗体相同）与荧光素标记的抗 CD 单抗同时检测。在分析待测血样结果时应减去同型对照的阳性结果，或以同型对照管为阴性管。

流式细胞术（流式细胞仪）。