阵发性睡眠性血红蛋白尿的检测 （Differential diagnosis of paroxysmal sleep hemoglobin urine）

正常人：CD55、CD59：阳性；

                         FLAER：阳性。

阵发性睡北性血红蛋自尿症( paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)是一种后天获得性、造血干细胞基因突变面引起的溶血性疾病，该疾病是由于PIGA基因突变，导致连接细胞膜的糖磷脂酰肌醇(glycophosphatidylinositol，GPI)相关锚蛋白缺失，红细胞表面缺乏补体调节蛋白如CD55、CD59而对补体敏感，介导血管内溶血的发生，出现血红蛋白尿。

在疾病的发展过程中，PNH有三个显著的临床特点，首先，以补体介导的血管内溶血为主要临床表现；其次，具有形成血栓的倾向，该血栓不仅可发生在四肢，还好发于特殊部位，如肝门( Budd- Chiari综合征)、脾、肠系膜静脉；另外有发展骨髓造血功能衰竭的潜在风险。所有患者当疾病发展到一定程度或是在疾病发展的终末期，表现为免疫介导的严重的再生障碍性贫血。要注意的是，患者临床表现的个体差异很大，不是每例PNH患者在就诊时都会出现这三个临床表现。

PNH克隆流式细胞术检测方案

1、红细胞表面CD5和CD59分子表达检测

红细胞膜CD5和CD59的缺失，被认为是引起PNH病理生理的主要原因。红细胞CD5和CD59分子表达检测就是明确鉴定和定量GPI相关锚蛋白缺失数(Ⅲ型细胞)，与正常细胞区别(Ⅰ型细胞)，或者部分缺失(Ⅱ型细胞)；同时比较红细胞FNH克降数和白细胞PNH克隆数，可以给临床提供更多信息。要注意的是，由于患者可能存在溶血和输血等因素的影响，单纯检测红细表面GPI锚蛋白的缺失并不能对PNH做出准确判断。

2、白细胞表面CD55和CD59分子表达检测

白细胞是检测PNH克隆大小的最好目标细胞，但是淋巴细胞不适合做PNH克隆检测，因为淋巴细胞寿命长，GP相关锚蛋白表达变异性很大。单核细胞和粒细胞都是非常好的可用于PNH克隆检测的靶细胞，一般来说这两种细胞检测出的克隆数目是一致的。分析两种细胞群可以更好地作出诊断。

对于PNH克隆大的病例，可以用一个GPI锚蛋白抗体如CD55或者CD59抗体、以直方图参数就可以体现阴阳性细胞群。但对于PNH克隆数量少的病例，需要收集更多的细胞，并需要用到2个不同的标志去找阴性目标细胞群。粒细胞GPI锚蛋白检测有很多抗体，一般多用CD16、CD24和CD66b。
    3、白细胞的FLAER法测定

以往都认为CD55和CD59是检测白细胞最好的抗体，但是与其他GPI锚蛋白抗体相比，它们有时候不容易区分阴、阳性细胞群，并且检测出的PNH克隆的能力有限。越来越多的数据表明：目前检测白细胞GPI相关锚蛋白缺失最好的试剂是荧光标记的气单胞菌溶素（aerolysin或FLAER）。

气单胞菌溶素( aerolysin)是一种细菌毒素，具有与细胞表面GPI结合、最终引起细胞裂解的能力。PNH细胞克隆缺乏GPI，不能与气单胞菌溶素结合，细胞不会被裂解。基于上述原理，人们研制出荧光素标记气单胞菌溶素前体的变异体( FLAER)，该物质能够有与细胞表面GPI结合的能力，却不会导致细胞裂解。因此根据细胞与 FLAER结合与否将GPI正常细胞与GPI缺失的细胞进行识别，从而可以对PNH细胞克隆进行判断。

最新研究表明，FLAER/CD157组合检出的PNH克隆与其他组合检出的克隆大小一致，且具有很高的敏感度和特异性。

1、标本选择。首选EDTA抗凝外周血，不建议采用骨髓标本做检测。因为由于细胞的分化发育会影响GPI相关锚蛋白的表达从而导致结果的较难解释。并且患有MDS的PNH病人结果的解释也比较困难，因为GPI锚蛋白的异常表达跟MDS也相关，尤其CD16的表达。

2、检测时间。冷藏保存7天的标本也可以进行红细胞检测，但建议在24h-48h内进行检测，否则红细胞检测结果的解释将会受到影响。采集标本放置时间越长，白细胞检测影响将会更大，白细胞内颗粒及抗体表达强弱均会受到影响，使得结果难以判断。

3、红细胞检测。红细胞是灵敏度检测最好的目标细胞（细胞多、抗体表达强），但红细胞容易聚集，同时由于溶血和输血的影响，不能完全反映其真实数据，因此需进一步检测白细胞表面GPI相关锚蛋白。

参考文献：吴长有.2014.流式细胞术的基础和临床应用.北京：人民卫生出版社。

流式细胞术（流式细胞仪）。