血小板检测

血小板降低：血小板数<100x10⁹/L为降低。

血小板增高：血小板数>400×10⁹/L为增高。

通过流式细胞术分析血小板数量、结构、功能、活化及血小板相关抗体等，在临床血栓与止血性疾病、遗传性血小板膜蛋白缺陷、获得性血小板功能缺陷、免疫性血小板减少症、炎性反应周围血管疾病以及动脉粥样硬化等疾病的辅助诊断和风险评估中发挥着非常重要的作用。

（一）血小板精确计数

临床上，血小板计数对于多种疾病的诊断、治疗、合理用药及手术前后监测具有十分重要的意义。精确的血小板计数是临床医生评价患者是否具有出血风险、是否需要预防性输注血小板的可靠依据。目前临床多采用全自动血细胞分析仪进行血小板计数，这是一种基于电阻抗的定量测定方法。根据血细胞的非传导性质，将血细胞悬浮在电解质溶液中，当悬浮的血细胞颗粒通过仪器的计数小孔时，引起电阻变化;细胞大小不同，其电阻变化幅度不同，从而对血小板进行计数。仪器法简便、快速，自动化程度高，具有较好的重复性，但不能与小红细胞、有核红细胞、小淋巴细胞、细胞碎片及其他一些与血小板大小相似的颗粒相鉴别，导致血小板计数偏高；而大的血小板因不能计数常导致计数偏低。而且当血小板计数<20×10⁹/L时，仪器法的准确性和重复性也减低。因此，2001年，国际血液学标准化委员会提出将流式免疫血小板计数法作为血小板计数的参考方法。

其检测原理是：荧光素标记的CD41或CD61单克隆抗体与已知体积标本中的血小板表面特异性膜糖蛋白结合，在流式细胞仪激光的激发下，检测结合在血小板表面的荧光参数同时参考血小板大小方面的信息，流式细胞仪即可对血液中的血小板进行直接测定。其临床意义为：

1、生理性

（1）剧烈运动后血小板增高，饱餐后也有增高，冬季略增高。

（2）妇女月经前血小板降低。

（3）少年较成年人血小板偏低。

（4）新生儿血小板数目较少医学/教育/网编辑整理，到3个月后至成人水平。

（5）静脉血血小板略高于外周血。

2、病理性

（1）血小板降低：血小板数<100x10⁹/L为降低。

①骨髓造血功能受损而导致血小板生成减少，如再生障碍性贫血、急性白血病、急性放射病、抗癌药的应用等。

②血小板破坏过多而致的血小板减少，如特发性血小板减少性紫癜、脾亢、体外循环等。

③血小板消耗过多而致的血小板减少，如弥散性血管内凝血（DIC）、血栓性血小板减少性紫癜。

④家族性血小板减少，如巨大血小板综合征。

（2）血小板增高：血小板数>400×10⁹/L为增高。

①组织受损及术后特别是脾切除后血小板可增高。

②血小板持续增高见于真性红细胞增多症、原发性血小板增多症。此外，慢性粒细胞白血病、多发性骨瘤及许多恶性肿瘤的早期常可见血小板增多。

③血小板一过性增高，见于急性感染、急性失血、急性溶血等急性反应。

（二）活化血小板测定

健康人循环血小板处于静止状态，静止状态的血小板内分布着多种颗粒，如а颗粒、溶酶体颗粒等。这些颗粒表面存在着一些特定蛋白，如а颗粒表面有CD62p抗原，溶酶体颗粒表面有CD63抗原。当一些刺激剂和血小板上的相应受体结合后，血小板被活化，此时由于颗粒膜蛋白与血小板膜蛋白相互融合，使颗粒膜蛋白翻转到血小板膜表面。因此，可通过流式细胞术检测这些外翻的颗粒膜蛋白来判断血小板的活化状态，还可通过检测血小板白细胞或单核细胞的黏附性来判断血小板的活化状态。

其流式细胞术检测基本原理为：采用荧光素标记的CD41或CD61单克隆抗体对标本中的血小板进行示踪，测定血小板表面CD62p和CD63的表达情况，判断机体血小板的活化状态。

活化血小板测定的临床意义在于：心肌梗死、脑血管血栓形成、深静脉血栓形成、脑栓塞和肺栓塞等血栓性疾病在中国有很高的发病率，也是致死的重要原因。血小板活化是血栓形成的重要环节，检测血小板的活化状态可辅助诊断和监控血栓性疾病，对判断血栓前状态意义也非常重大。活化血小板检测还可用于血小板减少性疾病的分类及指导治疗：肝素治疗最严重的并发就是血小板减少症和血栓症。FCM检测如发现体内血小板处于活化状态，应停用肝素，此时血小板减少症的相应症状可得以缓解。

（三）血小板膜糖蛋白检测

血小板膜糖蛋白根据膜糖蛋白在血小板分布部位的不同，血小板膜糖蛋白可分为质膜糖蛋白和颗粒膜糖蛋白。质膜糖蛋白主要存在于静止血小板膜表面，而颗粒膜糖蛋白则主要存在于血小板胞质内的δ颗粒、a颗粒和溶酶体颗粒。质膜糖蛋白主要包括GPIb/Ⅸ/V复合物(CD42b/CD42a/CD42d)、GPⅡb/Ⅲa复合物(CD41/CD61)、GPIa/Ⅱa复合物(CD49bCD29)、GPIc/Ⅱa复合物(CD49 e/CD49f/CD29)、GPⅣ(CD36)和GPⅥ等。颗粒膜糖蛋白主要包括a颗粒膜蛋白(a- granule membrane protein,GMP)(CD62p)和溶酶体膜蛋白，后者又包括溶酶体完整糖蛋白-1( lysosomal integral membrane glycoprotein,LIMP,CD63)、溶酶体相关膜蛋白(lysosome associated membrane glycoprotein,LAMP-1)和溶酶体完整膜糖蛋白(LAMP-2)。

流式细胞术检测血小板膜糖蛋白的基本原理是：利用两种以上不同荧光素标记的血小板膜糖蛋白特异性单克隆抗体(如CD61-FTC和CD41-PE)对血小板膜糖蛋白进行染色，通过流式细胞术分析血小板表面膜糖蛋白的表达情况。其检测的临床意义在于：

（1）诊断血小板无力症( Glanzmann thrombocytasthenia,GT)：CD41和CD61是GT的诊断指标。GT是由于GPⅡb/或GPⅢa基因缺陷导致血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb或GPⅢa)减少或质量异常，引起的血小板无凝集状态或反应降低。血小板GP检测对GT等血小板功功能缺陷疾病有重要价值。用荧光单抗直接标记血小板，FCM检测血小板GP的缺陷，简单快速、灵敏且特异，适合于临床GT的筛查与诊断。

（2）诊断巨大血小板综合征( Bernard-Soulier syndrome,BSS)：CD42b是BSS诊断指标。BSS是由于GPIb/ Ⅸ复合物缺陷，导致血小板功能异常所致。

（3）有助于BSS和常染色体显性遗传性血小板减少症的鉴别诊断。

（4）检测膜蛋白拮抗剂的疗效。

（四）血小板微粒测定

血小板微粒( platelet microparticles，PMPs)是活化血小板表面伸出的伪足断裂形成的颗粒物。由于PMPs表面含有血小板特异性膜糖蛋白(GPIb、GPⅡb和GPⅢa等)和凝血因子膜受体，可为凝血酶原反应提供催化表面，所以在止血和血栓形成中发挥重要作用，并成为血栓性疾病监测的重要指标。

流式细胞术检测PMPs的基本原理是：利用血小板微粒表面含有血小板特有CD61和CD41，用事先包被了CD61单抗的微球捕获标本中的血小板微粒，再利用CD4I-PE单抗与血小板循粒CD41的结合，从而通过流式细胞仪对标本中的血小板微粒进行测定。

PMPs为凝血酶原反应提供更大的催化表面,在正常的止血过程与出血和血栓性疾病的发生中起着重要的作用。特发性血小板减少性紫癜、肝素引起的血小板减少症、急性冠状动脉综合征、糖尿病、外科手术等多种出血和血栓性疾病中均可观察到PMPs数量的改变。

（五）血小板相关免疫球蛋白检测

免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）是一种自身免疫性疾病，主要由血小板抗体介导的血小板破坏 以及血小板生成受抑，引起血小板数量减少，临床上表现为出血或易于出血倾向 。

血小板相关免疫球蛋白（platelet-associated immunoglobulins,PAIg）在ITP发病中起着极其重要的作用，从而成为ITP实验诊断的一项敏感指标，PAIg包括PAIgA、PAIgM以及PAIgG。ITP患者血小板表面相关抗体大多数为IgG型，但仅测定单项PAIgG仍有假阴性病例，联合检测PAIgA、PAIgM和PAIgG可提高检测ITP的敏感度，减少漏诊。

统计PAIgA、PAIgM和PAIgG阳性血小板占血小板的百分率，参考范围一般为＜10%，采用不同荧光素标记抗体所得结果可能略有差异，应建立本实验室的参考范围。

参考文献：吴长有.2014.流式细胞术的基础和临床应用.北京：人民卫生出版社。

1、血小板在体外极易活化,因此对采血、标本运送及标记均有严格要求。采血时要求尽量不使用止血带，或者轻扎止血带；使用21号大针头、20ml塑料注射器抽血。抽血时，要求一针见血，轻轻拉动注射器；将标本注入试管时，应先打开管塞，取下针头，丢弃前2ml血沿管壁将血标本轻轻推入试管内，并轻轻旋转试管，使血标本与抗凝剂混合均匀；标本运送过程中要求保持试管直立并尽量平稳,样本标记需即时标记，标记过程中须避免剧烈震摇。

2、抗凝剂应使用109mmol/L的构橼酸钠，与血标本的比例为1:9。不能选用EDTA和肝素类抗凝剂，因为它们易引起血小板体外活化聚集，EDTA可引起血小板膜CD41/CD61二聚体复合物分离，减弱CD41或CD61单抗的结合能力；也不能选用ACD抗凝，因为ACD会导数血液pH偏低，使纤维蛋白原受体PAC-1结合率下降。

3、血小板精确计数时，加入标本的量必须准确，推荐使用反向加样技术，标本不要黏于管壁，且加样前标本需充分混匀。

4、PMPs测定时，无血小板血浆标本的制备为实验成功的关键。抗凝标本以每分钟3500转离心20分钟，分离血浆，此为无血小板血浆标本。要确保收获得无血小板血浆中血小板含量为0。

流式细胞术（流式细胞仪）。