文件名称：Reference and selected procedures for the quantitative determination of hemoglobin in blood； Approved standard—Third edition[血红蛋白定量测定 参考和选择程序；批准标准(第三版)]

发布日期：2000年

版本号：A3

适用范围：本文件详细描述了氰化高铁血红蛋白测定法检测血红蛋白的方法。该方法可用于：全自动血液分析仪血红蛋白测定的校准；血红蛋白测定质控物的定值；仪器或其他血红蛋白测定方法的评价；患者红细胞测定方式也用于血分析仪校准或质控；常规血液实验室疾病诊断和治疗检测为目的的血红蛋白测定。所以，该标准适用于所有需要进行血红蛋白浓度测定的临床实验室和相关仪器、试剂、校准物和质控物生产厂商。

主要内容：H15-A3文件发布于2000年，介绍了使用氰化高铁血红蛋白测定法检测血红蛋白的方法，包括试剂的组成、试剂性能要求、分光光度计的校准要求。该方法是全自动血液分析仪血红蛋白测定校准的参考方法，是评估其他血红蛋白测定方法的依据，当使用患者标本对血液分析仪进行校准时应使用该方法。本标准还单独规定了适合作为标准溶液的HiCN溶液的成分和光谱特性。该方法能够获得准确的血红蛋白浓度，HiCN校准物生产厂商可以本文件作为指南，用户亦可以从本文件获得对所用HiCN校准物的成分和纯度进行核查的必要信息。

国际血液学标准化委员会 (International Committee for Standardization in Haematology，ICSH) 分别于1978年、1987年和1996年提出血红蛋白测定的建议，将氰化高铁血红蛋白测定法作为参考方法。实验室常规使用的其他方法必须溯源至该方法，以保证检测结果具有良好的可比性。

文件还指出，不推荐使用酸化血红蛋白法，因为不可靠。

使用的仪器设备有：分光光度计、容量瓶、100μl 正向移液器、文齐液。

测定步骤：①取文齐液加至容量为25ml的A级容量瓶中，将试剂液面调至刻度线。②用正向置换移液器吸取 100μl 混匀全血，使用蘸有盐水的纱布小心快速地擦掉毛细管外壁残留的血液( 该过程应避免因虹吸作用带走毛细管内的血液)， 将毛细管中的血液加至装有试剂的容量瓶中，吹吸至少5次，以保证血液全部从毛细管中洗出。同一份标本分次稀释后检测结果的变异系数应＜0.5%。③盖上容量瓶盖子，充分颠倒混匀，直至红细胞完全溶解。④避光放置5min 以上，以保证血红蛋白完全转化成氰化高铁血红蛋白。⑤用滤器过滤稀释后的标本。滤液至少放置1min，以使气泡溢出。⑥使用分光光度计测定HCN 溶液的吸光度值。以试剂作空白，分别在504nm、540nm 和 750nm波长条件下读取HCN溶液的吸光度值。根据公式计算血红蛋白浓度。

本文件指出二级HiCN标准的性能指标，其组成为浓度为55 ～ 0.85mg/dl 的 HiCN 溶液，不含细胞碎片，不确定度小于0.5%。吸光度特性，纯度要求A540/A504 在 1.59 ～ 1.63，A750 应≤ 0.003，无菌，4 ～ 8℃避光保存。

附件中给出了使用参考方法评价常规仪器评价的方法。具体方法与EP9文件类似。

相关内容可以参考《卫生行业标准 WS/T 3412011 血红蛋白测定参考方法》。