《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）》指出“新型冠状病毒感染轻型表现需与其它病毒引起的上呼吸道感染相鉴别；新型冠状病毒肺炎主要与流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等其他已知病毒性肺炎及肺炎支原体感染鉴别”。
强调“对疑似病例要尽可能采取包括快速抗原检测和多重PCR核酸检测等方法，对常见呼吸道病原体进行检测”，什么是多重PCR核酸检测呢？常见已知呼吸道病毒包括哪些？能检测多少种病原体呢？
2019年11月15日国家药品监督管理局发布《呼吸道病毒多重核酸检测试剂技术审查指导原则》（2019年第80号）中提到，常见已知呼吸道病毒包括了八种常见呼吸道病毒：甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道感染肠道病毒（肠道病毒/鼻病毒）、冠状病毒。这些病毒感染的临床表现与新型冠状病毒肺炎有相似之处，难以通过临床表现、胸部影像学做鉴别，需要通过多种PCR技术手段检测病原体进行鉴别。
多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种PCR扩增技术，即可在一个反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段，目前多重PCR技术在临床诊断及生命科学研究的各个领域应用广泛。
多重PCR的技术难点在于：
平衡各对引物的扩增效率；
避免不同引物对间的相互干扰；
避免非特异性产物的扩增；
寻找合适的PCR产物鉴别的技术应用平台。
因此多重PCR技术难度大，产品开发周期长。常见的产物检测手段有：多通道荧光信号检测、熔解曲线法、毛细电泳片段分析方法、质谱法、高通量测序法等。多重PCR毛细电泳片段分析技术示意图如下。
多重PCR毛细电泳片段分析技术示意图
多重PCR具有高效性、系统性、经济、简便等优势，在多种病原微生物同时检测或鉴定、某些遗传病及癌基因的分型鉴定等领域有较多的应用。与普通PCR相比，多重PCR技术主要优势如下：
1、高效性。普通PCR往往使用多管才能完成检测多个靶标，而多重PCR可以在单管内同时完成多个目标靶点的检测，使用96孔板，实现一次可完成96个样本的高通量检测（含1个阳性对照和1个阴性对照），大大缩短检测时间，节省昂贵的聚合酶和模板，试剂准备时间也相对较少，提高检测效率。
2、质控完善。普通PCR一般仅包含IC质控，用于监控实验过程，无法监测样本质量问题导致的假阴性。多重PCR强大的拓展性可以在同一个管中设置多个质控，除监控实验过程的内部质控外，还可设置监控样本质量的质控，为结果的可靠性提供质量保障，大大降低假阴性概率；在多重PCR体系中加入反应内参作为内部质控，为其他扩增片段提供内部对照，内参与样本同管同步，保证样本检测结果的可靠性。
3、经济简便性。多重PCR由于其明显的技术优势，使得本来需要通过多个PCR反应实现的多种病原体的检测可在一个PCR反应中实现，同时扩展了单次检测的通量，消耗相对降低，性价比大大提高。
根据第六版诊疗方案，结合疫情鉴别诊断需求，我们对国内部分检测试剂做了简单的比较，各产品信息比较见下表。
从表中可见：
1、检测多重呼吸道病毒的产品有13种，其中使用到多重PCR技术5种（PCR毛细电泳片段分析法、液相芯片法、熔解曲线法、微流体芯片法、高通量测序法），同时满足从核酸提取、PCR到信号检测的整个实验过程中，检测指标均在同一管内完成的产品很少；
2、检测病原种类符合国家药监局的技术审查指导原则，满足诊疗方案鉴别诊断要求有6种产品；
3、获得国家药监局注册证（可用于临床检测）的产品有4种，明显少于仅可用于科研的产品，且4种产品中只有PCR毛细电泳片段分析法采用了多重PCR技术，可在同一管内同时检测13种病原体；
4、既有样本质控又有核酸提取质控有3种产品，此次新型冠状病毒核酸检测目前讨论较多是样本的采集和预处理不当，可能会导致假阴性问题，所以对样本质量的监控十分必要。
来源：检验医学网
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