材料与方法

一、材料

1．标本来源：

2020年1至2月，选择浙江大学医学院附属第二医院冠状病毒qPCR核酸检测阳性患者的咽拭子标本3份。3例患者在我院确诊，并转至杭州市定点医院进行了后续治疗。本研究已通过浙江大学医学院附属第二医院人体研究伦理委员会审批（（2020）伦理研第（161）号），并免除知情同意。

2．试剂与仪器：

EX3600全自动核酸提取仪（上海之江生物技术有限公司），MVR01核酸提取试剂（上海之江生物技术有限公司），2019-nCoV核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒有3个：分别为国家药品监督管理局审批通过的两种试剂（试剂1和试剂3）、新上市正在审批的一种试剂（试剂2），病毒标本保存液：细胞培养基RPMI -1640（美国HyClone公司）。Roche Cobaslightcyler 480荧光定量PCR仪（德国Roche公司）、恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）、干浴恒温箱（美国Thermo公司）。

二、方法

1．标本采样：

根据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》、《新型冠状病毒感染的肺炎疫情防控方案》和《WHO 2019新型冠状病毒指南》，咽拭子采样方法为：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽喉壁，将拭子头装入3 ml采样液的螺旋口。鼻拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，取另一根拭子采另一侧鼻孔，将两根拭子头浸入同一含3 ml采样液的螺旋盖采样管中。

2．标本稀释：

对3例新型冠状病毒核酸阳性的鼻咽拭子标本，分别用细胞培养基RPMI -1640进行了1×、10×、100×、1 000×、10 000×、100 000×和1×、10×、100×及1×、10×稀释的浓度梯度稀释，充分震荡混匀后等分为4份，每份300 µl。

3．标本病毒灭活：

取上述不同稀释度3份标本，分别采用56 ℃ 30 min水浴（灭活组1）、56 ℃ 60 min干浴（灭活组2）和60 ℃ 30 min干浴（灭活组3）3种病毒灭活方式进行灭活,另1份（不灭活组）标本暂置4 ℃冰箱冷藏保存。处理完毕后，按照提取试剂说明进行核酸提取。

4．核酸提取和荧光RT-PCR检测：

核酸提取使用上海之江生物的EX3600全自动核酸提取仪及配套的提取试剂（MVR01），每个样本需要300 μl的鼻咽拭子洗脱液。荧光RT-PCR检测分别使用3种2019-nCoV核酸RT-PCR检测试剂（试剂1，试剂2和试剂3），按照试剂说明书进行操作，在Roche Cobaslightcycler 480型荧光定量PCR仪上进行2019-nCoV qPCR核酸检测。试剂1检测ORF1ab基因和N基因；试剂2和试剂3检测ORF1ab基因、N基因和E基因，阳性判读标准参考试剂说明书。所有检测均进行3次重复，取平均循环阈值（cycling threshold，Ct）进行计算。

三、统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。对试剂12019-nCoV基因ORF1ab/N的未灭活和灭活组Ct值比较采用独立样本检验，不同稀释倍数下的Ct值差异比较采用独立样本检验。对灭活组与未灭活组的阳性检出率比较采用非参数检验的Mann-Whitney U检验；对3种试剂灭活前后及不同灭活方式反应的阳性率差异用非参数检验Kruskal-Wallis Test分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、不同标本稀释度对2019新型冠状病毒核酸荧光RT-PCR检测结果影响

本研究者选择本院3份病毒浓度不同的标本，根据病毒标本的原始Ct值进行10倍稀释。对1号标本进行了1×、10×、100×、1 000×、10 000×和100 000×的浓度梯度稀释，们对前5个稀释梯度的ORF1ab基因Ct值均值进行线性回归（试剂1），得到回归直线r=0.996，斜率为：3.066，直线方程式：Y= 3.066X + 22.81；前5个稀释梯度的N基因Ct值进行线性回归，r=0.997，斜率为：3.173，直线方程式：Y=3.173X + 23.97，具体见图1。当在未灭活处理时，直线回归后r值接近1，斜率接近3.33，说明病毒浓度经过不同的稀释，在同样的提取RNA和荧光定量RT-PCR扩增后，不同稀释浓度下提取和扩增效率一致，荧光定量扩增效率并没有因为标本的稀释而提取或扩增操作而下降。

图1. 1号标本不同稀释倍数下的扩增Ct值的直线回归方程式

二、病毒灭活处理与否对2019新型冠状病毒荧光RT-PCR检测Ct值影响

对实时荧光定量RT-PCR扩增结果进行统计分析，具体见表1和图2（试剂1），表1显示各标本不同稀释梯度下的ORF1ab基因和N基因的Ct值分布，4份实验标本中1号标本1×、10×、100×稀释倍数下均有明显的曲线扩增，故对前3个稀释倍数下的未灭活组和灭活组进行统计分析，发现未灭活组和灭活组Ct值没有统计学差异（ORF1ab基因：t=－1.416，P>0.05；N基因：t=－1.379，P>0.05）。灭活组之间Ct值也无统计学差异（ORF1ab基因：t=－0.460，P>0.05；N基因：t=－0.132，P>0.05）。

图2. 新型冠状病毒在不同稀释倍数下的灭活处理对荧光RT-PCR检测Ct值的影响

表1. 病毒灭活处理对2019新型冠状病毒核酸RT-PCR检测ORFab和N基因Ct值影响

当对不同稀释倍数下未灭活组和灭活组进行统计分析发现：1×时未灭活组和灭活组Ct值无统计学差异（ORF1ab基因：t=－1.652，P>0.05；N基因：t=－1.493，P>0.05），10×时未灭活组和灭活组Ct值有统计学差异（ORF1ab基因：t=－7.327，P<0.01；N基因：t=－19.340，P<0.01）。100×稀释倍数下未灭活组和灭活组Ct值有统计学差异（ORF1ab基因: t=－9.462，P<0.01；N基因：t=－18.583，P<0.01）。不同灭活组间比较，差异无统计学意义（P均>0.05）。

1号标本随着稀释倍数的增加时，未灭活组和灭活组间的荧光扩增曲线图间距增大，如图2所示。A和E为1号标本1×稀释浓度下，未灭活组和灭活组的ORF1ab基因和荧光扩增曲线间距差异不大，4条线几乎重叠；当稀释倍数扩大到10×时，未灭活组和灭活组的荧光扩增曲线有了一定的差距（图2B和F）；当稀释浓度达到100×时，未灭活组荧光扩增曲线与不同灭活组间距越来越大（图2C和G）。选择1号标本的灭活组1和未灭活组Ct值进行直线回归，如图2D和H，灭活组1的斜率大于未灭活组。

表2. 病毒灭活方式对荧光RT-PCR法检测2019-nCoV核酸阳性率的影响

图3. 病毒灭活处理对2019新型冠状病毒荧光定量聚合酶链反应检测结果影响

讨论

新型冠状病毒肺炎作为突发公共卫生事件，传播迅速广泛，给全世界人民的生命健康带来巨大威胁。经呼吸道飞沫和接触传播是主要的传播途径，人群普遍易感^[2]。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》（试行第六版）注明对冠状病毒理化特性的认识多来自对SARS-CoV和MERS-CoV的研究^[2]。病毒对紫外线和热敏感，56 ℃30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒^[7]。有关SARS灭活稳定性的文章发现：在56 ℃热处理30 min后，SARS病毒滴度低于检测限，60 ℃孵育30 min后，即使添加了20%胎牛血清，SARS病毒也灭活完全^[5,6]。鉴于此，本研究选择了56 ℃ 30 min水浴、56 ℃60 min和60 ℃30 min 3组灭活方式。

本研究对实时荧光定量RT-PCR扩增结果进行统计分析，4份实验标本中1号标本1×、10×、100×稀释倍数下均有明显的曲线扩增，对其进行未灭活组和灭活组分析，发现未灭活组和灭活组Ct值差异没有统计学意义，灭活组之间Ct值差异也无统计学意义。当对不同稀释倍数下未灭活组和灭活组进行统计分析却发现1×稀释倍数下未灭活组和灭活组Ct值差异无统计学意义，10×和100×稀释倍数下未灭活组和灭活组Ct值差异有统计学意义。1号标本随着稀释倍数的增加时，未灭活组和灭活组间的荧光扩增曲线图间距增大，见图2。直线回归方程也可看出，灭活处理后直线回归方程斜率明显大于未灭活组。可能当标本病毒在高浓度时，灭活与否以及不同的灭活处理对2019新型冠状病毒的阳性检出率影响不大，当标本病毒在低浓度时，灭活对造成病毒RNA的降解，影响检出率。华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科关于《新型冠状病毒流行地区临床实验室常见问题解答》（第一版）^[8]推荐：呼吸道标本先56 ℃干浴60 min，静置10 min至室温，然后进行处理。中山大学附属第一医院检验科陈培松等^[9]在之前的研究中发现56 ℃ 30 min和75%乙醇处理和没有灭活处理的标本结果具有明显的相关性且一致性良好。该论文检测标本Ct值均在18～26范围内，病毒检测浓度偏高，故灭活处理对核酸检测结果影响不大。近期南京大学模式动物研究所张沁欣等^[10]发现在没有核糖核酸酶抑制剂（Trizol）的保护下，56 ℃灭活这一步骤导致了猪流行性腹泻病毒冠状病毒RNA的明显降解，添加RNA酶抑制剂后则RNA降解的得到一定程度的改善。结合本研究发现灭活处理确实会造成RNA降解，且在病毒浓度较低时，影响较大。

比较总体阳性检出率发现，未灭活前的2019新型冠状病毒阳性检出率较高，灭活后核酸检测阳性率明显下降，但不同灭活组之间差异无统计学意义，不同检测试剂阳性检出率也无明显差异，但具体分析后发现，试剂1和试剂2扩增核酸时，灭活组1的阳性检出率较灭活组2和灭活组3高（分别为4/11，3/11和3/11），但由于数据较少，并不能给出具体的指导。本单位的2019新型冠状病毒核酸检测采样管为15 ml离心管，病毒保存液为细胞培养基，并未添加RNA酶抑制剂，故本研究后续还应探讨更大样本下的不同病毒浓度在不同灭活处理条件下对弱阳性标本的检出率影响，以及增加RNA酶抑制剂或者其他病毒保存基质对于灭活处理处理的弱阳性标本的阳性检出情况，并希望通过去除可能的RNA酶干扰等情况探索出一种合适实验室灭活病毒的方法。

本研究建议建议各实验室根据实验室自身情况，做好各实验室检测系统下2019新型冠状病毒灭活前后的检测评估，慎重选择是否进行检测前灭活及选择合理的灭活方式，避免漏检造成的潜在病毒传染源。

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献

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[4] 中华人民共和国国家卫生健康委员会.新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）的通知（国卫办科教函[2020]70号）.[S]. 2020:2020-01-23.

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[7] 国家卫生健康委办公厅.新型冠状病毒肺炎防控方案（第五版）国卫办疾控函〔2020〕156号[S]. 2020.

[8] 华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科.新型冠状病毒流行地区临床实验室常见问题解答（第一版）[R].,2020.

[9] 陈培松，何宇婷，黄裕立，等.不同方式灭活口咽拭子标本对2019新型冠状病毒实时荧光定量PCR检测结果的影响[J].中华检验医学杂志,2020.

[10] 张沁欣，赵庆顺.病毒核酸提取前的高温灭活过程显著降低可检出病毒核酸模板量[J]. [ChinaXiv:202002.00034],2020.

中华检验医学杂志, 2020,43：网络预发表. DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20200227-00138